Sledování methioninu v českých a zahraničních pivech

Prekursory sirných těkavých látek jsou sirné aminokyseliny a hlavně sirná aminokyselina methionin. Byl sledován obsah methioninu v českých a zahraničních pivech zakoupených v obchodní síti. Byla optimalizována metoda stanovení methioninu v pivu pomocí plynové chromatografie se selektivním plamenofotometrickým detektorem. Při validaci metody se dosáhlo těchto parametrů LOD 0,80 mg.l⁻¹, LOQ 2,5 mg.l⁻¹, R2 0,99974, RSD 13 %.

1 ÚVOD

Většina sirných sloučenin přítomných v pivu jsou netěkavé látky (aminokyseliny, bílkoviny, anorganické sírany). Tyto látky nejsou přímo odpovědné za nepříznivé vůně a chuti piva, ale jsou důležité jako prekursory, ze kterých za určitých podmínek mohou vznikat senzoricky aktivní látky. Takto vzniklé sloučeniny jsou ve většině případů těkavé a jejich množství bývá nižší než 1 % z celkového množství látek, které mají ve své molekule síru a jsou obsaženy v pivu. Skutečná množství látek odpovědných za sirné vůně jsou proto extrémně nízká.

Methionin je esenciální sirná aminokyselina. Je stavební jednotkou bílkovin a je donorem aktivních methylových skupin. Methionin zahajuje biosyntézu bílkovin, ale v rámci posttranslačních modifikací bývá následně z N-konce peptidového řetězce odštěpen (1,2).

S-methylmethionin vzniká metylací methioninu v cyklu sirných aminokyselin (obr. 1) a patří mezi hlavní meziprodukty vzniku senzoricky aktivních látek během výroby piva (2,3). S-methylmethionin je hlavním prekursorem dimethylsulfidu.

Obr. 1 Vznik S-methylmethioninu

Zcela převládajícím postupem analýzy obsahu sirných aminokyselin v reálných vzorcích jsou chromatografické metody (4,5,6,7), především plynová chromatografie a kapalinová chromatografie. U plynové chromatografie lze navíc využít selektivní detektory (8,9,10). Sirné aminokyseliny však nelze plynovou chromatografií stanovit bez derivatizace. Derivatizace se provádí ke zvýšení těkavosti a zlepšení stability separovaných aminokyselin (6,7).

K derivatizaci sirných aminokyselin lze využít několik derivatizačních metod (6,7,8):

• Esterifikace karboxylu bezvodým alkoholem v HCl a následná acylace dalších protických funkčních skupin.
• Silylace protických funkčních skupin za tepla v bezvodém prostředí pomocí trimethylsilyl nebo terc-butyldimethylsilyl derivátů.
• Derivatizace alkyl chlorformiáty.

K detekci sirných aminokyselin lze použít FID (plameno ionizační detektor) i FPD (plameno fotometrický detektor – selektivní pro sirné látky) detektor. Velmi výhodné je spojení plynového chromatografu s hmotnostním detektorem.

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

Chemikálie

D, L – methionin (Fluka, USA), pyridin (Merck, Německo), ethanol (ML Chemica, ČR), methanol, 1-propanol, chloroform, ethyl chlorformiát (Sigma Aldrich, USA), destilovaná voda.

Vzorky piv

Ke sledování obsahu volné sirné aminokyseliny methioninu v pivu bylo analyzováno celkem 48 různých druhů českých a zahraničních piv zakoupených v obchodní síti. Pro analýzu bylo vybráno 18 českých světlých ležáků, 8 českých světlých výčepních piv, 6 českých tmavých piv a 3 česká nealkoholická piva. Dále bylo analyzováno 13 zahraničních světlých ležáků. Z toho byly 3 z Dánska, 3 z Francie, 1 z Holandska, 2 z Japonska, 1 z Německa a 3 z USA.
Příprava a zpracování vzorků piv

25 ml piva bylo odpěněno v ultrazvukové lázni po dobu 15 min. Takto připravený vzorek piva byl použit na derivatizaci.

Derivatizace vzorků

K 300 μl odpěněného piva se přidalo 200 μl směsi propanol-pyridin (4:1), následně se přidalo 25 μl ethylchlorformiátu. Směs se míchala 3 minuty při laboratorní teplotě, poté se přidalo 700 μl chloroformu obsahujícího 1 % ethylchlorformiátu. Směs derivatizovaného vzorku se po protřepání centrifugovala (5 min, 5000 min⁻¹) a pak se 500 μl organické fáze převedlo do nové zkumavky. Chloroform se odpařil proudem plynného dusíku do sucha. Zbytek po odpaření se rozpustil v 200 μl methanolu. Takto připravený vzorek byl analyzován plynovou chromatografií.

Příprava standardů methioninu

Standard methioninu byl navážen na analytických vahách s přesností na 0,1 mg, rozpuštěn v destilované vodě, kvantitativně převeden do 25 ml odměrné baňky a objem byl doplněn destilovanou vodou po rysku. Rozsah koncentrací standardu methioninu byl 0,8 až 14 μg.ml⁻¹.Na derivatizaci bylo použito 300 μl standardního roztoku.

Instrumentace a chromatografické stanovení

Analýzy vzorků byly prováděny na plynovém chromatografu (Trace GC Ultra, Thermo Finigan, USA) s plamenofotometrickým detektorem (FPD) selektivním pro síru. K separaci analyzovaných látek byla použita kapilární kolona RTX-5 (15 m x 0,32 mm i.d., 0,25 μm, stacionární fáze 5 % difenyl – 95 % dimethylpolysiloxan) s následujícím teplotním programem: počáteční teplota 100 °C po dobu 0,5 min, nárůst teploty 6 °C.min⁻¹ do 180 °C, setrvání 3 min, nárůst teploty 10 °C.min⁻¹ do 280 °C, setrvání 1 min. Konstantní průtok nosného plynu He 1.5 ml·min⁻¹. Teplota SSL injektoru 250 °C, splitless režim 0,8 min, průtok 60 ml·min⁻¹. Teplota detektoru 150 °C, průtok vzduchu 105 ml·min⁻¹, průtok vodíku 90 ml·min⁻¹, průtok dusíku (make-up) 20 ml·min⁻¹.

Identifikace analyzovaného methioninu byla provedena na základě porovnání retenčních časů se standardem, kvantifikace byla provedena pomocí kalibrační křivky.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Vzorky piv byly pro stanovení methioninu zpracovány optimalizovaným pracovním postupem (11), vlastní stanovení methioninu bylo provedeno metodou GC/FPD. Jeho obsah byl vypočítán pomocí softwaru ChromCard 2.4.0 z kalibrační křivky (obr. 2 ). Identifikace vzniklého N(O,S)-ethoxykarbonylpropyl esteru methioninu byla potvrzena porovnáním naměřeného hmotnostního spektra se spektrem uváděným v literatuře. Chromatogram vzorku piva je znázorněn na obr. 3. Hmotnostní spektrum vzniklého derivátu methioninu je na obr. 4.

Obr. 2 Kalibrační křivka methioninu

Obr. 3 Chromatogram vzorku piva

Obr. 4 Hmotnostní spektrum N(O,S)-ethoxykarbonyl propyl esteru methioninu

Metoda pro stanovení methioninu metodou GC/FPD s kapilární kolonou RTX-5 byla validována (12,13). Pro validaci byl použit odplyněný náhodně vybraný vzorek piva. Validované parametry byly vyhodnoceny s použitím softwarového programu Effi Validation 3.0 a validační parametry jsou uvedeny v tab. 1.

Tab.1 Validační parametry

Ke sledování obsahu volných sirných aminokyselin v pivu bylo vybráno 35 českých a 13 zahraničních piv. Jednalo se o 31 světlých ležáků, 8 světlých výčepních piv, 6 tmavých piv a 3 nealkoholická piva. Výsledky stanovení methioninu jsou uvedeny na obr. 5–9.

Obsahy methioninu se v českých světlých ležáckých pivech pohybovaly v rozmezí 3,4–12,9 mg.l⁻¹ (obr. 5). Rozdíly mezi jednotlivými druhy piv nebyly výrazné, kromě světlého ležáku (vzorek č. 17), kde hodnota methioninu byla výrazně vyšší (12,9 mg.l⁻¹).

Obr. 5 Obsah methioninu v českých pivech – světlé ležáky

Obsahy methioninu se v českých výčepních pivech pohybovaly v rozmezí 4,0–6,0 mg.l⁻¹ a rozdíly mezi jednotlivými druhy piv nebyly výrazné (obr. 6).

Obr. 6 Obsah methioninu v českých pivech – výčepní piva

Obsahy methioninu se v tmavých pivech pohybovaly v rozmezí 3,4–6,3 mg.l⁻¹ (obr. 7) a rozdíly mezi jednotlivými druhy piv nebyly výrazné.

Obr. 7 Obsah methioninu v českých pivech – tmavá piva

Obsahy methioninu v nealkoholických pivech se pohybovaly v rozmezí 3,4–3,7 mg.l⁻¹ (obr. 8 ). Tyto obsahy byly nejnižší ze všech analyzovaných vzorků piv.

Obr. 8 Obsah methioninu v českých pivech – nealkoholická piva

Obsahy methioninu se v zahraničních pivech u světlých ležáků pohybovaly v rozmezí od 4,3–20,8 mg.l⁻¹ (obr. 9 ). Nejvyšší obsah methioninu byl v dánském světlém ležáku (20,8 mg.l⁻¹), u tří zahraničních piv se hodnoty pohybovaly v rozmezí 4,3–7, 6 mg.l⁻¹. Obsah methioninu u zbývajících zahraničních piv (9 vzorků) byl pod mezí stanovení.

Obr. 9 Obsah methioninu v zahraničních pivech – světlé ležáky

4 ZÁVĚR

Sirné aminokyseliny jsou přirozenou součástí ječmene, sladu i piva. Kromě fyziologické role jsou však tyto látky prekursory při vzniku těkavých sirných látek, které mohou negativně ovlivnit senzorickou kvalitu piva.

Byla sledována sirná aminokyselina methionin jako hlavní prekursor při vzniku těkavých sirných látek v českých a zahraničních pivech. Obsah methioninu v českých pivech se pohyboval v rozmezí 3,4–12,9 mg.l⁻¹. Nejvyrovnanější obsahy byly u tmavých a u nealkoholických piv. Největší rozdíly v obsahu methioninu byly u ležáků, kde nejvyšší obsah methioninu byl prokázán u vzorku piva č. 17. Ve všech českých pivech byl obsah methioninu nad mezí stanovení. V zahraničních pivech byl obsah methioninu z celkem analyzovaných 12 vzorků zjištěn pouze u 4 vzorků. Jednalo se o piva z Dánska (2), Francie a USA. Ve všech ostatních vzorcích zahraničních piv byl obsah methioninupod mezí stanovení.

Objektivní posouzení příčin těchto rozdílů by vyžadovalo konkrétní znalost technologie výroby jednotlivých analyzovaných zahraničních piv.