Stanovení methioninu ve sladu

Těkavé sirné látky mají nezanedbatelnou roli v senzorické jakosti piva. Jejich prekursory jsou sirné aminokyseliny a hlavně sirná aminokyselina methionin. Byl sledován obsah methioninu ve sladech vyrobených ze šesti odrůd ječmene (Bojos, Jersey, Malz, Prestige, Tolar a Xanadu) ze dvou lokalit (Branišovice, Hrubčice). Dále byl sledován obsah methioninu v závislosti na teplotě hvozdění (pražení). Byla optimalizována metoda stanovení methioninu ve sladu pomocí plynové chromatografie se selektivním plamenofotometrickým detektorem. Při validaci metody se dosáhlo těchto parametrů LOQ 1,6, R² 0,99974, RSD 15 %.

1 ÚVOD

Sirné aminokyseliny jsou přirozenou součástí ječmene, sladu i piva a jsou prekurzory těkavých sirných látek, které mají nezanedbatelnou roli v senzorické jakosti piva. Tyto těkavé sirné látky mohou nepříznivě ovlivnit chuť piva i ve velmi nízkých koncentracích. Proto je nutné znát nejen obsah jejich prekurzorů, ale i možnosti jejich vzniku v průběhu technologie výroby piva.

Mezi hlavní meziprodukty při vzniku senzoricky aktivních sirných látek během výroby piva patří S-methylmethionin, který vzniká metylací methioninu v cyklu sirných aminokyselin (obr. 1).

Obr. 1 Vznik S-methylmethioninu

Během hvozdění sladu, když teplota přesáhne 60 °C, je S-methylmethionin degradován na homoserin a dimethylsulfid, takže nezanedbatelná část může vytěkat do plynné fáze. Syntéza a degradace S-methylmethioninu je závislá na vlhkosti a teplotě zrna. Oxidací uvolněného dimethylsulfidu vzniká dimethylsulfoxid. Rychlost oxidace roste s teplotou hvozdění. Rozsáhlejší oxidace dimethylsulfidu vede ke vzniku dimethylsulfonu (1).

Další cestou vzniku dimethylsulfidu je rozklad methioninu vzájemnou reakcí s redukujícími cukry (obr. 2). Hlavním produktem této degradace je methional nebo od něj odvozený methionol. Dalšími dvěma produkty jsou dimethylsulfid a dimethylsulfoxid. Rozkladem methionalu může vznikat ethylmethylsulfid. Termickým rozkladem cysteinu a cystinu vzniká sirovodík (2).

Obr. 2 Možný mechanismus syntézy polysulfidů z methioninu během rmutování sladu

Během rmutování přechází S-methylmethionin, vzniklý při sladování, do roztoku, kde probíhá jeho rozklad. Vznikající dimethylsulfid je za varu strháván parami. Rychlost vypařování dimethylsulfidu je v této fázi rychlejší než jeho syntéza (2).

Po vaření piva dochází v chladnoucí mladině stále k degradaci S-methylmethioninu, ale již nedochází k odpařování dimethylsulfidu (2).

V ležáckých pivech se nachází dimethyltrisulfid, který vzniká degradací methionalu a methionolu v čerstvém pivu. Methional pochází především ze Streckerovy eliminace methioninu při sladování ječmene (2).

Stanovení sirných aminokyselin v potravinách je jednou z nejnáročnějších analytických operací v oblasti analýz potravin. Musí se zvolit taková metoda dělení a stanovení, která zaručuje dostatečnou přesnost a správnost, musí být dostatečně rychlá a experimentálně akceptovatelná. Analýza sirných aminokyselin je navíc komplikována přítomností dalších složek v potravinách, které dané stanovení mohou rušit nebo mohou dávat pozitivní chyby.V současné době je využívána ke stanovení sirných aminokyselin především plynová chromatografie (GC). Před vlastní analýzou je třeba sirné aminokyseliny derivatizovat. Derivatizace sirných aminokyselin se provádí za účelem jejich transformace na produkt se žádanými separačními a detekčními vlastnostmi. Při GC analýze se musí zajistit úplné zablokování protických funkčních skupin (mají aktivní vodíky např. -OH, -SH, -NH₂) a zvýšení těkavosti sirných aminokyselin (3).

K derivatizaci sirných aminokyselin lze využít několik derivatizačních metod (3,4,5):

• Esterifikace karboxylu bezvodým alkoholem v HCl a následná acylace dalších protických funkčních skupin.
• Silylace protických funkčních skupin za tepla v bezvodém prostředí pomocí trimethylsilyl nebo terc-butyldimethylsilyl derivátů.
• Derivatizace alkyl chlorformiáty.

K detekci sirných aminokyselin lze použít FID (plamenoionizační detektor) i FPD (plamenofotometrický detektor – selektivní pro sirné látky) detektor. Velmi výhodné je spojení plynového chromatografu s hmotnostním detektorem.

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

Chemikálie

D, L – methionin (Fluka, USA), pyridin (Merck, Německo), ethanol (ML Chemica, ČR), methanol, 1-propanol, chloroform, methyl chlorformiát, ethyl chlorformiát (Sigma Aldrich, USA), destilovaná voda.

Vzorky sladu

Bylo analyzováno 12 vzorků sladů, které byly vyrobeny z 6 odrůd jarního ječmene (Bojos, Jersey, Malz, Prestige, Tolar a Xanadu) a které pocházely ze dvou šlechtitelských a zkušebních stanic (Branišovice, Hrubčice) ze sklizňového ročníku 2007.

U vybraného vzorku sladu bylo v průběhu hvozdění (pražení) sladu odebíráno 18 vzorků. První vzorek byl odebrán při 50 °C a poslední při 220 °C, teplotní interval odebírání byl 10 °C.

Příprava a zpracování vzorků sladu

5 g pomletého sladu se 15 min extrahuje v ultrazvukové lázni směsí destilované vody s methanolem (4:1). Po sonifikaci se směs převede do centrifugační zkumavky a odstředí (15 minut, 6500 min⁻¹). 1 ml supernatantu se převede do mikrozkumavky a centrifuguje (5 minut, 5000 min⁻¹). Z čirého roztoku se odebere 300 ml vzorku na derivatizaci.

Derivatizace vzorků

K 300 μl vodného roztoku vzorku se přidá 200 μl směsi propanol-pyridin (4:1), následně se přidá 25 μl ethyl chlorformiátu. Směs se míchá 3 minuty při laboratorní teplotě, poté se přidá 700 μl chloroformu obsahujícího 1 % ethyl chlorformiátu. Směs derivatizovaného vzorku se po protřepání centrifuguje (5 minut, 5000 min⁻¹) a pak se 500 μl organické fáze převede do nové zkumavky. Chloroform se odpaří proudem plynného dusíku do sucha. Zbytek po odpaření se rozpustí v 200 μl methanolu. Takto připravený vzorek se analyzuje plynovou chromatografií.

Příprava standardů methioninu

Standard methioninu byl navážen na analytických vahách s přesností na 0,1 mg, rozpuštěn v destilované vodě, kvantitativně převeden do 25 ml odměrné baňky a objem byl doplněn destilovanou vodou po rysku. Rozsah koncentrací standardu methioninu byl 0,8 až 14 mg.μl⁻¹. Na derivatizaci bylo použito 300 μl standardního roztoku.

Instrumentace a chromatografické stanovení

Analýzy vzorků byly prováděny na plynovém chromatografu (Trace GC Ultra, Thermo Finigan, USA) s plamenofotometrickým detektorem (FPD) selektivním pro síru. K separaci analyzovaných látek byla použita kapilární kolona RTX-5 (15m x 0.32 mm i.d., 0.25 mm, stacionární fáze 5 % difenyl – 95 % dimethyl polysiloxan) s následujícím teplotním programem: počáteční teplota 100 °C po dobu 0,5 min, nárůst teploty 6 °C.min⁻¹ do 180 °C, setrvání 3 min, nárůst teploty 10 °C min⁻¹ do 280 °C, setrvání 1 min. Konstantní průtok nosného plynu He 1.5 ml.min⁻¹. Teplota SSL injektoru 250 °C, splitless režim 0,8 min, průtok 60 ml.min⁻¹. Teplota detektoru 150 °C, průtok vzduchu 105 ml.min⁻¹, průtok vodíku 90 ml.min⁻¹, průtok dusíku (make-up) 20 ml.min⁻¹.

Identifikace analyzovaného methioninu byla provedena na základě porovnání retenčních časů se standardem, kvantifikace byla provedena pomocí kalibrační křivky.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Nejdříve bylo nutné zvolit nejvhodnější extrakční činidlo pro extrakci volného methioninu ze vzorků sladů. Pro optimalizaci extrakce methioninu ze sladu byly testovány extrakční směsi methanol-voda, ethanol-voda a propanol-voda v poměru 1 : 4. Jako nejvhodnější byla vybrána směs methanol-voda a u této směsi byly testovány různé poměry methanolu a vody (1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6). Na základě dosažených experimentálních výsledků byla zvolena extrakce methioninu směsí methanolvoda v poměru 1 : 4. Účinnost extrakce byla určena podle velikosti ploch píků analytů. Extrakce methioninu směsí ethanol-voda a propanol-voda vykazovaly výrazně menší výtěžnosti než směs methanol-voda, což je znázorněno pro poměr 1 : 4 na obr. 3.

Obr. 3 Optimalizace extrakce methioninu (směs 1:4)

Pro analýzu methioninu je rozhodující volba derivatizačního činidla. Při optimalizaci derivatizace byla testována dvě derivatizační činidla pro přípravu N(O,S)-alkoxykarbonyl propyl ester derivátů methioninu. Testovanými derivatizačními činidly byly methyl chlorformiát a ethyl chlorformiát (obr. 4). U vzniklých derivátů methioninu byly srovnány plochy píků. Z experimentálních výsledků deprivatizace standardu byl pro derivatizaci methioninu použit ethyl chlorformiát.

Obr. 4 Optimalizace volby derivatizačního činidla

Byla optimalizována a validována metoda stanovení methioninu ve sladu (6,7). Validační parametry jsou uvedeny v tab. 1.

Tab. 1 Validační parametry

Vzorky sladů byly pro stanovení methioninu zpracovány optimalizovaným pracovním postupem, vlastní stanovení methioninu bylo provedeno metodou GC/FPD. Jeho obsah byl vypočítán pomocí softwaru ChromCard 2.4.0 z kalibrační křivky. Chromatogram vzorku sladu je znázorněn na obr. 5.

Obr. 5 Chromatogram vzorku sladu

Obsahy methioninu v analyzovaných vzorcích sladu z obou lokalit (Branišovice a Hrubčice) se pohybovaly od 23,0 do 36,0 mg/g. Slady vyrobené z odrůd Malz, Radegast a Tolar měly při vzájemném porovnání srovnatelné obsahy methioninu v obou lokalitách. Slady vyrobené z ječmenů z pěstební lokality Branišovice měly obsahy methioninu u jednotlivých odrůd vyrovnané. U sladů vyrobených z pěstební lokality Hrubčice byl výrazně vyšší obsah methioninu u od růd Bojos a Sebastian než u ostatních analyzovaných odrůd (obr. 6).

Slady sladované (pražené) při teplotách 50 až 220 °C vykazovaly snižující se koncentraci methioninu se vzrůstající teplotou. Tato závislost je způsobena degradací methioninu na dimethylsulfid, který ze sladu uniká. Výsledkem odbourávání sirných aminokyselin jsou senzoricky aktivní sirné látky (8). Na obr. 7 je znázorněna závislost obsahu methioninu na teplotě hvozdění respektive pražení sladu.

4 ZÁVĚR

Byla optimalizována a validována metoda stanovení methioninu ve sladu. Optimalizace extrakce spočívala v použití různých extrakčních rozpouštědel, pro optimalizaci derivatizace byla srovnávána dvě derivatizační činidla. Na základě experimentálního ověření byla zvolena jako nejvhodnější extrakce směsí methanol-voda (1:4) a derivatizace ethyl chlorformiátem.

Významný rozdíl v obsahu methioninu z pohledu lokalit i odrůd byl pouze u odrůdy Bojos a Sebastian.

Při analýze sladů hvozděných (pražených) při různých teplotách byla prokázána závislost poklesu obsahu methioninu na vzrůstající teplotě. Tato skutečnost souvisí s degradací sirných aminokyselin na jednodušší těkavé sirné látky. Prokázanou závislost obsahu metioninu a teploty lze využít při optimalizaci teploty hvozdění, s cílem snížit obsah metioninu ve vyráběných sladech.