Metody pro ověřování autenticity odrůd chmele – účinný nástroj proti falzifikaci

K pokusům o falzifikaci dochází téměř u všech komodit a výjimkou není ani chmel. Je proto nezbytné hledat způsoby, jak ověřovat jeho autenticitu. Přehledový článek shrnuje moderní metody pro ověřování autenticity chmele a uvádí rovněž nejnovější výsledky spolupráce Výzkumného ústavu pivovarského a sladařského, a.s. a Chmelařského institutu, s.r.o., v Žatci. K ověřování autenticity chmele se používají metody chemotaxonomické a genetické. V roce 2015 byly provedeny chemické analýzy novošlechtěných hybridů pro České pivo (obsah a složení alfa a beta kyselin, obsah a složení chmelových silic, obsah celkových polyfenolů) a byly provedeny molekulárně-genetické analýzy 150 vybraných genotypů chmele ze světového sortimentu a šlechtitelského materiálu. Pomocí výsledků byl z testovaných genotypů sestaven přehledný dendrogram. Autoři se dále zabývali profilováním českých odrůd chmele na základě chemických profilů proanthokyanidinů a podařilo se jim pomocí klastrové analýzy jasně odlišit odrůdy chmele včetně jejich genetické příbuznosti.

1 ÚVOD

Autenticita potravin je termín, který jednoduše označuje, zda potraviny nakupované spotřebitelem odpovídají jejich popisu, a je aktuálním tématem v nejrůznějších potravinářských komoditách. Proto je v současné době věnováno mnoho pozornosti a jsou vynakládány nemalé finanční prostředky na vývoj analytických metod pro ověřování autenticity potravin, nápojů a jejich surovin.

Také chmel je komodita, ve které dochází k falzifikaci původu a odrůd, což může ve velké míře ovlivnit senzorický profil piva z něho vyrobeného. Žatecký poloraný červeňák (ŽPČ) je na trhu všeobecně považován za světový standard kvality v kategorii aromatických chmelů. Prvotřídní kvalitě odpovídá i vyšší cena. V uplynulých letech bylo zaznamenáno několik opakovaných případů jeho falzifikace. Falzifikace Žateckého poloraného červeňáku ve formě granulí byla prokázána na základě výsledků chemických a genetických analýz suroviny. V případě chemických rozborů se jednalo o analýzy chmelových pryskyřic, silic a prenylovaných flavonoidů. Přítomnost či absence některých látek, jejich obsahy a vzájemné poměry jsou odrůdově specifické. Velmi citlivé na přítomnost příměsí je složení chmelových silic. V případě Žateckého poloraného červeňáku je spolehlivým markerem autenticity β-farnesen, jehož obsah v silicích se pohybuje kolem 15 %. Ve falzifikovaných chmelech byl jeho obsah pouze 5 %. Přítomny byly naopak jiné látky, které se v silicích ŽPČ běžně nevyskytují. V jednom případě nebyl β-farnesen vůbec nalezen, což jednoznačně dokazuje, že zákazníkovi byla v tomto případě podvržena zcela jiná odrůda nebo směs odrůd.

Ověřování odrůdové čistoty chmele se v ČR provádí pod státním dozorem (ÚKZÚZ, Ústřední kontrolní a zkušební ústav zemědělský) v průběhu celého výrobního cyklu počínaje přípravou sadbového materiálu, kontrolou vysázených porostů a konče zpracováním sklizeného chmele na výrobky. Spolehlivost identifikace chmelových odrůd obecně závisí na stáří vzorků a na způsobu zpracování. Jak pro chemotaxonomické, tak pro genetické analýzy obecně platí, že stárnutím vzorků se míra průkaznosti snižuje. Modelové pokusy ukázaly, že přítomnost příměsi cizí odrůdy je prokazatelná přibližně od 10 % hm. V případě chmelových extraktů jsou genetické metody nepoužitelné, protože procesní podmínky DNA destruují nebo odstraňují (Krofta a Patzak, 2011). Z toho jasně vyplývá, že mají své nezastupitelné místo jak metody genetické, tak i chemotaxonomické. Je vhodné oba postupy kombinovat, pokud to okolnosti, např. množství vzorku, umožňují.

Tento přehledový článek shrnuje moderní metody pro ověřování autenticity chmele a kromě přehledu zahraničních a domácích prací uvádí nejnovější výsledky spolupráce Výzkumného ústavu pivovarského a sladařského, a.s., a Chmelařského institutu, s.r.o., v Žatci.

2 CHEMOTAXONOMICKÉ METODY

Chemotaxonomické metody jsou založeny na chemické analýze vybrané látky nebo skupiny látek, jejich koncentraci a jejich vzájemném poměru. V odborné literatuře se lze setkat s termíny jako profilování či „otisk prstu – fingerprint“. Může se jednat jak o analýzy cílené, kde se vyhodnocují koncentrace a poměry látek známých (profilování), nebo metody necílené, kde se pomocí speciálních statistických softwarů vyhodnocují získané výstupy – otisky prstu. Analýzu lze dále klasifikovat podle typu analyzovaných látek (v případě chmelu silice, pryskyřice, polyfenolové látky) a podle typu použité instrumentace. Dosud vyvinuté a publikované metody využívají profilování jedné ze tří (nebo kombinaci) skupin sekundárních metabolitů chmele, tedy chmelových pryskyřic, silic a polyfenolových látek. Následující text zahrnuje historický vývoj metod od základních skupinových používaných rutinně pro stanovení kvalitativních parametrů chmele až po ty nejmodernější instrumentálně náročné metody používané v současnosti k ověřování autenticity chmele.

2.1 Chmelové pryskyřice (hořké kyseliny)

Analytické metody stanovení chmelových pryskyřic, zejména alfa-hořkých kyselin, se vyvíjely souběžně s pokrokem ve výzkumu jejich složení. Gravimetrické a titrační metody používané do 50.–70. let minulého století nahradily a doplnily metody spektrofotometrické, chromatografické, popř. elektroforetické. Jejich zavádění bylo umožněno rychlým vývojem v oblasti instrumentální techniky, zejména kapalinové chromatografie (HPLC). Nové postupy v analytice chmelových pryskyřic si vynutil i vývoj nových chmelových výrobků jako například chmelových extraktů, pre-izomerovaných produktů aj. Analytické postupy stanovení jednotlivých frakcí a složek chmelových pryskyřic lze obecně rozdělit na skupinové a specifické. Chemická struktura cílových analytů poskytuje fyzikální základ řadě analytických metod. Například dvojné vazby v pěti- či šestičlenném cyklickém jádru způsobují silnou absorpci ultrafialového záření. Přímé spektrofotometrické stanovení alfa- a beta-hořkých kyselin se provádí na základě měření absorbancí toluenového extraktu chmele v prostředí alkalického methanolu při vlnových délkách 275, 325 a 355 nm (Analytica ASBC, 1992).

Gravimerická Wöllmerova metoda je typickou skupinovou metodou (Wöllmer, 1925). Umožňuje stanovit ve chmelu veškeré, měkké a tvrdé pryskyřice, dále obsah alfa-hořkých kyselin a beta frakce. Metoda prošla během let několika modifikacemi, z nichž dosud poslední (Ganzlin, 1975) je součástí platných metodik (Analytica EBC, 1998). Nejvýznamnější úpravou je nahrazení gravimetrického stanovení alfa-hořkých kyselin konduktometrickou titrací roztokem octa nu olovnatého. Alfa kyseliny vytváří se solemi Pb2+ nerozpustnou sraženinu sytě žlutého zabarvení. Výsledek titračního stanovení je označován jako konduktometrická hodnota chmele a vyjadřuje se v hmotnostních procentech. Přestože princip stanovení je poměrně jednoduchý, celý analytický postup obsahuje několik důležitých operací, které významně ovlivňují výsledek analýzy. V první řadě je to extrakce alfa-hořkých kyselin z chmele vhodným rozpouštědlem (methanol, dietylether, toluen, isopropylalkohol, dichlormethan aj.) za mechanického míchání. Rozpouštědla se dávkují samostatně nebo v kombinaci s vodnými roztoky kyselin nebo pufrů (Anderegg, 1994). Dalším úskalím titračních metod je selektivita srážecí reakce. Olovnatými ionty se sráží nejen alfa-hořké kyseliny, ale i některé minoritní složky chmelových pryskyřic. Hlavním motivem pro existenci různých titračních metod jsou pokusy najít optimální kompromis mezi kvantitativní extrakcí alfa kyselin na jedné straně a omezením extrakce balastních látek na straně druhé. Přes zatížení řadou systematických chyb jsou titrační metody pro svou jednoduchost a rychlost v praxi velmi rozšířené (Analytica EBC, 1998; Analytica ASBC, 1992). Je však nutné mít na paměti, že každá metoda poskytuje jiný výsledek a vzájemné „přepočítávací“ koeficienty neexistují.

Obsah kohumulonu ve chmelu, resp. jeho podíl v celkovém obsahu alfa-hořkých kyselin byl prvním používaným parametrem pro odlišení odrůd chmele. Nickerson a Williams v roce 1986 zjistili, že odrůdová specificita může být navíc ovlivněna meziročně v závislosti na klimatu a v neposlední řadě místem původu. Aby bylo možné charakterizovat odrůdu s vyšší přesností, navrhli přidat další chemické charakteristiky, což je podstata chemického profilování (Nickerson et al., 1986).

Krofta v roce 2003 publikoval studii, kde srovnával chemické profily vybraných českých a zahraničních chmelů, zahrnující vysoko obsažné hořké odrůdy, jemné aromatické odrůdy a odrůdy hybridní. Kromě profilů silic, porovnával obsahy alfa kyselin, beta kyselin a podíl kohumulonu (Krofta, 2003). Autor zjistil a zdokumentoval charakteristické rozsahy koncentrací charakteristických látek studovaných chmelových odrůd. Z výsledků dále vyplývá, že rozlišení zahraničních odrůd chmele za použití pouze určení spektra silic není dostačující, přestože tradiční středoevropské jemné aromatické odrůdy chmele mají charakteristický obsah několika silic. Podobně lze interpretovat výsledky autorů Štěrba et al. z roku 2015, kde autoři v 3D projekci rozlišili 4 české odrůdy chmele (Agnus, Premiant, ŽPČ and Sládek) právě na základě obsahů alfa kyselin, beta kyselin a linalolu (Štěrba et al., 2015).

Autoři Jelínek et al. v roce 2010 studovali odlišnosti v chemickém složení sekundárních metabolitů (alfa-hořké kyseliny, beta-hořké kyseliny, silice, polyfenoly) u sedmi českých odrůd chmele (Agnus, Bor, Harmonie, Premiant, Rubín, Sládek, ŽPČ). Ze získaných dat vytvořili dichotomický klíč k určení české odrůdy chmele na základě chemické analýzy (Jelínek et al., 2010). Tento klíč byl později rozšířen i o další odrůdy a ještě dále zpřesněn (Jelínek et al., 2011). Při tvorbě klíče je nutné brát v úvahu i fakt, že obsahy těchto sekundárních metabolitů nejsou závislé jen odrůdově, ale jejich obsah ovlivňuje i pěstební lokalita, stáří rostliny a její infekce viry (Jelínek et al., 2012).

Všechny výše uvedené studie, korelující obsah alfa- a beta-hořkých kyselin s odrůdovou specifitou, byly provedeny pomocí dnes již rutinní HPLC metody. V roce 2012 byla publikována studie, kde autoři pro metabolomické profilování a rozlišení 13 odrůd chmele použili soubor instrumentálně náročných metod, a to LC-MS, FTMS (hmotnostní detekce s Fourierovou transformací), ESI-TFICR-MS (elektrospray ionisation Fourier transform ion cyclotron resonance) a NMR (Farag et al., 2012), pomocí kterých se jim kromě získání jasně odlišných chemických profilů podařilo identifikovat 18 hořkých kyselin. Navíc se ukázalo, že metoda FTMS není pro tyto účely vhodná, neboť se nepodařilo rozdělit izomerní sloučeniny humulon a adhumulon. V roce 2014 stejný autor vydal studii, ve které pomocí 2D NMR spektroskopie charakterizoval 13 odrůd chmele (Farag, 2014). I když je NMR instrumentace náročná a stále ještě ne úplně běžná v provozních laboratořích, vlastní příprava vzorku a optimalizace metody je ve srovnání s HPLC rychlá a jednoduchá, výsledky jsou dobře reprodukovatelné.

2.2 Chmelové silice

Analýza chmelových silic představuje dvě na sebe navazující operace. Prvním krokem je izolace silic z chmele či chmelového preparátu, po které následuje vlastní analýza složení silic. Zatímco k analýze silic se používá výhradně plynová chromatografie v různém instrumentálním provedení, k izolaci silic z chmelové matrice existuje několik principiálně odlišných postupů.

Nejstarší a stále rozšířenou izolační metodou je destilační postup, při kterém jsou složky silice uvolňovány z matrice destilací s vodní párou. Celý postup se provádí na speciální destilační aparatuře zpravidla za atmosférického tlaku, ale jsou popsány i postupy, kterými je izolace provedena za sníženého tlaku. Destilační metoda je časově náročná a k dosažení spolehlivých výsledků vyžaduje poměrně velké množství chmele (min. 50 g). Uvádí se, že destilace za atmosférického tlaku vede k degradativním změnám aroma, takže aroma výsledné silice neodpovídá vůni původního chmele (Rettberg et al., 2012). Extrakční postupy používají k izolaci silic organická rozpouštědla jako je například hexan, ethanol, trichlorethylen nebo methylenchlorid (Laws, 1981). Při odpařování rozpouštědla však dochází ke ztrátám nejtěkavějších složek, což vede ke změnám charakteru aroma získané silice (Pickett, 1975). Další nevýhodou těchto extraktů je možná přítomnost reziduálních zbytků rozpouštědla.

Principiálně odlišný přístup k analýze chmelových silic je založen na přímém vzorkování plynné fáze nad pevným vzorkem v uzavřené vzorkovnici. Tyto postupy jsou často označovány jako „head space“ metody. Existují v statickém nebo dynamickém uspořádání. Ve statickém provedení je vzorek plynné fáze, po inkubaci vzorku při zvýšené teplotě, dávkován přímo na analytickou kolonu plynového chromatografu (Freundorfer, 1991). Dynamický postup založený na termické desorpci (DTD - Direct Thermal Desorption) použili k analýze chmelových silic Eri et al. (2000). Při aplikaci této metody jsou složky chmelových silic termicky uvolňovány z matrice v desorpční komoře a proudem inertního plynu nanášeny na analytickou kolonu.

Jinou technikou separace těkavých látek z plynné, kapalné i pevné fáze je mikroextrakce na tuhou fázi (SPME, solid-phase microextraction) (Arthur et al., 1992). Metoda, která nepoužívá žádná rozpouštědla, je založena na sorpci analytů na povrchu křemenného vlákna pokrytého aktivní vrstvou sorbentu nebo polymeru. Vlákno může být ponořeno do kapaliny nebo v provedení „head space“ exponováno v plynné fázi nad kapalným nebo pevným vzorkem. Metoda HS-SP-ME byla s úspěchem použita i pro izolaci chmelových silic (Field et al., 1996; Krofta a Čepička, 2000; Kovačevič a Kač, 2001). Nejpoužívanější jsou vlákna na bázi polydimethylsiloxanu (PDMS 100 μm, PDMS/DVB 65 μm). Největší výhodou „head space“ metod je malé množství vzorku potřebné k izolaci, tj. méně než 1 gram. V případě HS-SPME provedení postačuje jedna hlávka chmele, dokonce i zeleného čerstvě utrženého na chmelnici. Tímto způsobem lze rychle a snadno zjistit případnou příměs cizí odrůdy v porostu chmele. Další velkou výhodou jsou nízké teploty při extrakci (40–50 °C po dobu 30–60 minut), které minimalizují sekundární změny ve složení silic.

Konečně v roce 2015 byla kolektivem autorů vyvinuta a publikována metoda založená na principu extrakce na fluidním loži (Štěrba et al., 2015). K extrakci je zapotřebí pouze 2 g mletého chmele, extrakce probíhá ve čtyřech šestiminutových cyklech do ethanolu. Protože jsou silice extrahovány parami ethanolu, nejsou vystaveny vysoké teplotě, pouze 78 °C, což je šetrný způsob z hlediska jejich možné degradace.

Zásadní pokrok v analýze chmelových silic přineslo v 50. letech minulého století zavedení plynové chromatografie (GC) a posléze i kapilárních kolon. Teprve jejich použití poprvé odhalilo, jak složitou směsí různých látek chmelové silice jsou. Buttery a Ling (1967) tak na 50m kovové kapilární koloně rozdělili silice několika odrůd na téměř 100 složek. Šíře poznatků o složení chmelových silic narůstala souběžně s pokrokem v analytické instrumentaci, a to nejen v oblasti separačních kolon, ale také v oblasti detektorů. Rutinní analýza složení chmelových silic se provádí jednorozměrnou plynovou chromatografií ve spojení s plamenově-ionizačním detektorem (GC-FID) nebo hmotnostním detektorem (GC-MS). Spojení plynového chromatografu s hmotnostním detektorem se pro další vývoj v této oblasti ukázalo jako klíčové, protože MS detektory jsou nejen dostatečně citlivé, ale hmotnostní spektra poskytují užitečné informace o možné struktuře látek a jejich molekulové hmotnosti. Problém rutinních analýz spočívá v omezené separační schopnosti analytických kolon. Teoretická separační kapacita 50m GC kolony je omezena na cca 250 píků (Bartle, 2002).

Roberts a Lewis (2000) s využitím GC/MS/TOF identifikovali 440 látek. Při analýze chmelových silic dochází proto k četným koelucím. Navíc eluční pásy nejsou na chromatogramu distribuovány rovnoměrně. To vede k tomu, že identifikace neznámých, senzoricky aktivních minoritních složek chmelových silic, koeluujících s většími píky, je velmi obtížná. Řešením je aplikace vícerozměrné plynové chromatografie, která používá k separaci dvě kolony s odlišnou polaritou stacionární fáze. Separační kapacita plynové chromatografie v dvourozměrném uspořádání (GC x GC) je podstatně vyšší, než separace na jedné koloně. V kombinaci s hmotnostním detektorem typu TOF (time of flight), který charakterizuje látky na základě přesných molekulových hmotností, vzniká velmi účinný identifikační nástroj neznámých složek chmelových silic (Roberts et al., 2004). Vícerozměrné techniky se používají většinou pro výzkumné účely, protože jejich potenciál objevit nové senzoricky aktivní látky je obrovský.

Silice se jako markery odrůdové specifity začaly uplatňovat v chemotaxonomických studiích v druhé polovině 20. století a byla publikována řada prací věnovaných diferenciaci chmelových odrůd. V těchto pracích se kromě odrůdové specifity často objevuje také vliv pěstebního regionu, tedy složení půdy a klimatu. V roce 1984 byla publikována velice obsažná práce, ve které autoři pomocí destilace s vodní párou a GC-MS analyzovali 148 chmelových odrůd ze Severní Ameriky a Evropy. Na kapilární GC koloně rozlišili 117 píků odpovídajících silicím; data po zpracování pomocí multivariační analýzy prokázala odrůdovou i regionální korelaci mezi chmelovou odrůdou a chemickým profilem silic (Stenroos a Siebert, 1984).

Autoři Rigby and Bethune využili pro charakterizaci 16 různých chmelových odrůd klasickou přípravu vzorku pomocí destilace s vodní párou, analýzu silic provedli pomocí GC s teplotně vodivostním detektorem. Jedním ze zajímavých závěrů je vzájemná korelace mezi obsahem myrcenu a kohumulonu (alfa kyselina) a také mezi obsahem humulenonu (silice) a humulonu (alfa kyselina). Dále bylo zjištěno, že evropské odrůdy chmele obsahují obecně méně myrcenu a více humulenonu ve srovnání s odrůdami ze Severní Ameriky (Rigby a Bethune, 1957).

Nickerson a Van Engel identifikovali pomocí kapilární GC 250 chmelových silic. Z tohoto spektra vybrali 22 látek, které tvořily tzv. profil složek chmelového aroma (HACP z angl. hop aroma component profile), látky kvantifikovali jako nanolitry dané silice na gram chmele (1 ppm, v/w). Tímto způsobem porovnával HACP extrakty 7 komerčních vzorků pelet (Cascade, Chinook, Cluster, Hallertau, Saaz, Tettnang, and Willamette), extrakty připravili pomocí destilace s vodní párou. Kromě porovnání HACP chmelových silic z extraktů srovnávali změněný HACP těchto látek v mladině a hotovém pivu. Bylo zjištěno, že v rámci jedné odrůdy se celkový HACP může během technologického procesu změnit až o 50 %. Zároveň autoři navrhli zavedení nové jednotky „jednotka chmelového aroma“ pro charakterizaci chmelové odrůdy pomocí sumy 22 vybraných silic (1 nl/g) podobně jako se běžně používá jednotka hořkosti pro charakterizaci obsahu hořkých látek chmele (Nickerson a Van Engel, 1992).

Vzhledem k vysokým úbytkům chmelových silic během varního procesu je instrumentálně velmi obtížné stanovit silice v hotovém pivu. Jejich nízké koncentrace navíc ovlivněné matričním efektem se pohybují často na limitu detekce. Inui et al. použili pro stanovení spektra silic v pivu dvoudimenzionální plynovou chromatografii (GC x GC) s hmotnostním detektorem TOF, který umožňuje velice přesné měření. Autor se zaměřil na detekci 67 vybraných složek silic, které byly korelovány s vybranými senzorickými deskriptory. Na základě výsledné, velmi dobré korelace, výsledků necílové analýzy GC×GC-TOF/MS s výsledky senzorické analýzy pomocí PCA lze konstatovat, že tato metoda je účinným nástrojem pro vysvětlení rozdílů chmelového aroma v pivu (Inui et al., 2013).

Extrakce silic ve chmelu pomocí metody headspace SPME s následnou GC analýzou byla použita pro verifikaci 4 chmelových slovinských odrůd (Aurora, Celeia, Magnum and Savinjski Golding). Autoři této práce identifikovali 11 sloučenin (silic) charakteristických pro danou odrůdu. Profily těchto silic po chemometrickém zpracování dat dobře korelovaly s analyzovanou odrůdou (Kovačevič a Kač, 2001).

Stejná technika byla použita ve studii, kde byl pomocí vybraných terpenoidních sloučenin (13 monoterpenů, 10 sequiterpenů, 3 oxidované monoterpeny, a jeden hemiterpen) získán metabolomický profil těchto látek v odrůdě Saaz (Žatecký poloraný červeňák). Ze studie vyplývá, že tato odrůda obsahuje charakteristicky vysoké koncentrace myrcenu, alfa-humulenu a beta-caryofylenu (Goncalves et al., 2012).

Farag et al. použili pro profilování chmelových silic ve 13 odrůdách chmele metodu dvoudimenzionální NMR; autoři identifikovali a kvantifikovali alfa-humulen, linalool a myrcen (Farag et al., 2014).

2.3 Polyfenolické látky

První pokusy o stanovení polyfenolů lze doložit již z konce 19. století, kdy se polyfenoly z chmelového extraktu odstraňovaly pomocí prášku z vyčiněné kůže (hide powder) nebo želatiny a sledoval se buď hmotnostní úbytek, nebo změna spotřeby při titraci manganistanem draselným. Nevýhodou těchto metod byly zejména nepřesné výsledky způsobené jak rozdílnou povahou jednotlivých složek poly fenolů, tak i v případě prášku z vyčiněné kůže velká variabilita v jeho složení (Chapman, 1905).

V roce 1907 Chapman popsal gravimetrické stanovení polyfenolů. Chmel extrahoval vroucí vodou a polyfenoly v extraktu vysrážel pomocí cinchoninsulfátu (Chapman, 1907). Tento způsob byl modifikován např. Lingem a Nanjim (1921), kteří místo gravimetrické koncovky použili polarimetrické měření, tj. měření optické otáčivosti (stočení roviny polarizovaného světla cinchoninsulfátem). Byla vypracována ještě celá řada optických nebo volumetrických metod ke stanovení celkových polyfenolů, v současnosti je v metodice EBC uvedena metoda založená na reakci polyfenolů extrahovaných horkou vodou v alkalickém prostředí s železitými ionty a měření absorbance proti slepému pokusu při 600 nm (Analytica EBC, 2015), jejímž základem je práce De Clerka a Jerumanise (1967).

Vzhledem k různorodé povaze polyfenolů vyvstala během času potřeba jejich selektivnějšího stanovení. První metodu pro stanovení anthokyanogenů v pivovarství publikoval McFarlane et al. (1955). Metoda je založena na konverzi anthokyanogenů povařením s kyselinou chlorovodíkovou a následné extrakci červeně zbarvených sloučenin amylalkoholem nebo butylalkoholem. Další možností jejich stanovení je adsorpce anthokyanogenů na polyamidový prášek a následné povaření s kyselinou chlorovodíkovou, vzniklé zbarvení se měří při 550 nm (Harris a Ricketts, 1958). Vzhledem k citlivosti metody na způsob provedení byly vyvíjeny další metodiky (Basařová a Černá, 1974), např. Franken-Luykx vypracovala metodu založenou na reakci antho-kyanogenů s molybdenanem sodným v neutrálním prostředí za vzniku hnědého zbarvení, které se měří při 400 nm, avšak tato metoda je méně selektivní, protože molybdenan může kromě anthokyanogenů reagovat i s katechinem (Basařová a Černá, 1974).

Další skupinou polyfenolů stanovovaných ve chmelu jsou tanoidy. Jejich stanovení se provádí nefelometricky. Ve vodném výluhu chmele se sleduje tvorba zákalu po přídavku PVP, koncentrace tanoidů odpovídá objemu PVP při maximální hodnotě zákalu (Basařová, 1993; Chapon, 1993).

K přesné identifikaci jednotlivých složek polyfenolů došlo až s příchodem chromatografie, jednotlivé látky (např. kvercetin, kvercitrin, kempferol, rutin, chlorgenová kyselina, kyanidin, delfinidin, galová kyselina atd.) byly identifikovány, příp. semikvantifikovány pomocí 2D tenkovrstvé (papírové) chromatografie (např. Harris, 1956; Hubáček a Trojna, 1964; Karel, 1960).

Metody založené na HPLC separaci byly poprvé popsány v 80. a 90. letech 20. století (např. McMurrough, 1981; Jerumanis, 1985). McMurrough stanovil mono-, di- a trimery flavonolů a flavonol mono-, di- a triglykosidy, více polymerované složky nebyly stanoveny. Jerumanis použil extrakci acetonem a přečištění vzorku na polyamidu 6, ve vzorcích stanovil katechin, prokyanidin B3 a prokyanidin C2, přičemž nejvyšší koncentrace byly zjištěny u katechinu.

De Cooman et al. použil pro rozlišení 3 odrůd chmele (Saaz, Wye Target a Nugget) chemotaxonomickou metodu založenou na principu stanovení všech tří hlavních chemických skupin chmelových látek. Pomocí metody PCA vyhodnotil získané profily silic, hořkých látek a flavonoidů, látek ze skupiny polyfenolů. Flavonoidy analyzoval pomocí metody HPLC s UV detekcí (De Cooman et al., 1998).

Jerkovic et al. (2005) analyzoval koncentraci stilbenů ze skupiny polyfenolů (cis- a trans- resveratrol a cis- a trans-piceid) v peletách devíti odrůd chmele pomocí metody HPLC a detekcí MS s chemickou ionizací za atmosférického tlaku (APCI). Z výsledků srovnání celkové koncentrace stilbenů a alfa-kyselin vyplývá, že čím menší koncentraci alfa-kyselin odrůda obsahuje, tím je větší obsah stilbenů.

Magalhãese et al. (2010) publikoval práci, ve které popsal separaci katechinu a epikatechinu a dále objasnil strukturu více než 30 polyfenolických látek zahrnujících kromě proanthokyanidinů také např. xanthohumol a kvercetin. Tyto látky extrahoval z chmele, směs absorboval na PVPP (polyvinylpolypyrrolidone), a následně je desorboval směsí aceton/voda (7:3, v/v). Elucidace získaných sloučenin byla provedena pomocí kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostní detekcí.

Li a Deinzer, kteří použili k identifikaci nově izolovaných proanthokyanidinů ze 13 odrůd chmele metody HPLC-APCI-MS (vysoko-účinná kapalinová chromatografie s hmotnostní detekcí, chemická ionizace) a HPLC-ESI-MS (ionizace elektrosprejem), poprvé popsali závislost zastoupení jednotlivých analogů proanthokyanidinů ve vzorku chmele na jeho odrůdě (Li a Deinzer, 2006).

Jejich výsledky byly ověřeny ve studii autorů Olšovská et al., kteří potvrdili závislost profilu proanthokyanidinů na odrůdě chmele. Chemické profily proanthokyanidinů byly naměřeny ve vzorcích ze dvou po sobě jdoucích sklizní ze 4 odrůd českého chmele (ŽPČ, Sládek, Premiant a Agnus), které byly analyzovány metodou HPLC- TOF/ MS. Ve vzorcích extrahovaných směsí aceton/voda (70/30) identifikovali di-, tri- and tetramery proanthokyanidinů, zejména katechinu, epikatechinu, gallokatechinu a epigalokatechinu. Na základě zastoupení těchto oligomerů prokázali autoři nejen odrůdovou, ale i lokalitní specifitu (Olšovská et al., 2013).

U některých odrůd chmele jsou také velmi charakteristické obsahy některých prenylflavonoidů. Zcela unikátní odrůdou je v tomto směru česká odrůda Vital, která má velmi vysoký obsah desmethylxantho-humolu. Na základě obsahů těchto typů látek můžeme určení odrůdy ještě dále zpřesnit (Krofta et al., 2015).

3 GENETICKÉ METODY

Historicky byly odrůdy chmele (Humulus lupulus L.) hodnoceny podle morfologických znaků révy a hlávek. Příchod metod analytické chemie sekundárních metabolitů umožnil precizní analýzu obsahu a složení chmelových pryskyřic, silic a polyfenolů (Krofta a Patzak, 2011). Chemotaxonomie chmele vychází z faktu, že složení sekundárních metabolitů je v určitých parametrech odrůdově charakteristické a jen mírně ovlivněno podmínkami pěstování a prostředí. V současnosti je využití DNA molekulárně genetických metod nejlepším nástrojem pro hodnocení jednotlivých genotypů. Oproti chemickým analýzám nejsou DNA analýzy ovlivněny věkem chmelových rostlin a dalšími faktory prostředí. DNA molekulární metody nám umožňují kontrolovat změny způsobené kombinacemi rodičů, chybami přenosu, mutacemi a selekčním tlakem, vyhodnocovat příbuznost jednotlivých genotypů nebo variabilitu (diverzitu) uvnitř populace.

V posledních 20 letech bylo vyvinuto a použito několik metod analýzy DNA založených na polymorfismu restrikčních fragmentů (RFLP) a polymerázové řetězové reakci (PCR) pro hodnocení chmelových genotypů. RFLP byl použit pro charakterizaci chloroplastové DNA, ribozomální RNA a 7SL RNA na začátku molekulárně genetické éry (Pillay a Kenny, 1994; 1996b; Matoušek a Trněná, 1996; Matoušek et al., 1999; Arnold a Jeltsch, 1999). Polymorfismus náhodně amplifikované DNA (RAPD) byl použit jako první PCR metoda pro identifikaci rozdílů mezi odrůdami chmele (Abbott a Fedele, 1994; Jakše et al., 1994; Pillay a Kenny, 1996a; Vejl, 1997; Patzak et al., 1999; Šustar-Vozlič a Javornik, 1999; Murakami, 2000). S vývojem sekvenčních technologií pak bylo možné charakterizovat RAPD produkty a použít je v metodě specifických sekvenčních míst (STS) u genotypů chmele (Brady et al., 1996; Tsuchiya et al., 1997; Araki et al., 1998; Murakami, 1998). Další metodou, využívající neznámé sekvence, byl amplifikovaný délkový polymorfismus fragmentů (AFLP), který kombinuje RFLP a PCR. Je citlivější pro genotypizaci chmele (Hartl a See-felder, 1998; Seefelder et al., 2000; Townsend et al., 2000; Jakše et al., 2001; Patzak, 2001; 2002; Fleischer et al., 2004; Townsend a Henning, 2009; Reeves a Richards, 2011; Solberg et al., 2014) a dokáže detekovat též somaklonální variabilitu (Patzak, 2003; Pe-redo et al., 2006; 2008; 2009). Neznámé sekvence v systému molekulární hybridizace byly využity v technologii rozlišovacích čipů (DArT) (Howard et al., 2011). Ale lepší pro identifikaci a determinaci chmelových odrůd je využít DNA specifické sekvenční metody, jako již zmíněnou metodu STS pro strukturní geny (Patzak et al., 2007; Bassil et al., 2008; Castro et al., 2008; Venger et al., 2015). Mikrosatelitní nukleotidové (di- nebo tri-) repetice jsou nejpoužívanější pro molekulárně genetickou analýzu variability a hodnocení biodiverzity u různých druhů rostlin. Jsou vysoce polymorfní, multi-alelické, často kodominantní, vysoce reprodukovatelné a náhodně a široce rozmístěné v genomu (Powell et al., 1996). Můžeme je využít nespecificky jako sekvence PCR primerů v metodě inter-jednoduchých sekvenčních repetic (ISSR) (Patzak, 2001; Danilova et al., 2003). Standardně se však využívají přímo v reakcích jednoduchých sekvenčních repetic (SSR). Proto byly a jsou SSR markery nejpoužívanější pro genotypování a studium molekulární variability u chmele (Jakše et al., 2001; 2002; 2004; 2008; Čerenak et al., 2004; Hadonou et al., 2004; Murakami et al., 2006a; b; Bassil et al., 2008; Štajner et al., 2005; 2008; Peredo et al., 2010; Patzak et al., 2010a; b; Horreo et al., 2014; Karlsson Strese et al., 2014; Mongelli et al., 2015; Korbecka-Glinka et al., 2016). Většina SSR markerů se nachází v nekódujících oblastech genomu. Nárůst informací pomocí sekvenování nové generace (NGS) transkriptomu (Nagel et al., 2008; Clark et al., 2013; Xu et al., 2013) a celého genomu (Natsume et al., 2015) zcela naplnil DNA sekvence genů chmele v EST databázích GeneBank, které tak poskytly možnost vyhledat nové specifické molekulární markery. Z těchto informací pak byly odvozeny nové molekulární markery typu jednoduchých sekvenčních repetic v exprimovaných sekvenčních úsecích (EST-SSR) (Patzak a Matoušek, 2011; Jakše et al., 2011; Koelling et al., 2012; Singh et al., 2012) a jedno-nukleotidového polymorfismu (SNP) (Matthews et al., 2013; Yamauchi et al., 2014; Henning et al., 2015). Nedávno byla vydána studie představující efektivní markerovací systém pro genotypování a kontrolu autenticity českých odrůd chmele založený na EST-SSR, který byl implementován do systému identifikace odrůd chmele a kontroly čistoty sadbového materiálu (Patzak and Matoušek, 2013a; 2013b). Tento systém v PCR amplifikuje alely těchto genů: WRKY transkripční faktor 1 (WRKY1), 2-C-methyl--D-erythritol 2,4-cyclodifosát synthasa (CMPS), leukoantokyani-din reduktasa 1 (LAR1) a vápník-vazebný EF hand family protein (CaEFh). Doplněný dvěma dříve publikovanými STS lokusy genů chalkon synthasy 1 (CHS1) a endochitinasy 1 (HCH1) (Patzak et al., 2007) pak úspěšně a přesně identifikuje a determinuje všechny české registrované odrůdy. Pro potřeby identifikace 135 světových odrůd chmele, které jsou v kolekci Chmelařského institutu, s.r.o., v Žatci, je nutné rozšířit molekulární markerovací systém. Z 269 SSR, STS a EST-SSR amplifikovaných markerů bylo pomocí programu MinimalMarker identifikováno 15 markerů (Fujii et al., 2013), které efektivně rozliší všechny použité odrůdy, s výjimkou původem shodných genotypů Žateckého, Spaltského, Tettnangského a Nadwislavského chmele. K již dříve zmíněným tak přibyly HlGA3, HlGA29 a HlAGA7 (Jakše et al., 2002; Štajner et al. 2005) z SSR markerů, NDBP (Patzak et al., 2007) z STS a EST-SSR markery ESTGA5 (Patzak a Matoušek, 2011), flavanon 3-hydroxylasy (F3H), MYB transkripčního faktoru 5 (MYB5), celulasy 1 (CEL1), intenzivního genu kyseliny giberelinové (GAI1) a oxidasy 2 kyseliny giberelinové 2 (GA2oxy2) (Patzak a Henychová, 2016).

4 NEJNOVĚJŠÍ POZNATKY

Jak bylo ukázáno na řadě příkladů, pokud jsou chemotaxonomické metody založeny na stanovení více typů látek (sekundárních metabolitů) chmele, je korelace s odrůdou mnohem vyšší. Ve spojení s výsledky genetické analýzy jsou dnes metody ověřování autenticity chmele velice přesné. V roce 2011 publikovali autoři Krofta et al. studii, kde stanovovali chmelové pryskyřice, silice a prenylflavonoidy u 11 českých registrovaných chmelových odrůd. V roce 2015 byly provedeny chemické analýzy dalších novošlechtěných hybridů pro České pivo (obsah a složení alfa a beta kyselin, obsah a složení chmelových silic, obsah celkových polyfenolů). Byly provedeny molekulárně-genetické analýzy 150 vybraných genotypů chmele ze světového sortimentu a šlechtitelského materiálu. Pro molekulární analýzy bylo využito 7 SSR, 9 STS a 35 EST-SSR markerů, jež celkem amplifikovaly 269 polymorfních produktů. Na základě těchto výsledků autoři sestavili dendrogram, zahrnující novošlechtěné hybridy zařazené do Státních odrůdových pokusů. Nejnovější výsledky, které budou použity mj. pro Atlas českých odrůd chmele po zařazení nových kultivarů na Listinu povolených odrůd, jsou uvedeny na obr 1.

Obr. 1 Dendrogram genetických vzdáleností 150 odrůd světového sortimentu chmele na základě 238 polymorfních molekulárních markerů

V loňském roce byla v časopise Kvasný průmysl publikována práce zabývající se profilováním českých chmelových odrůd na základě chemických profilů proanthokyanidinů (Olšovská et al., 2015). Výsledky klastrové analýzy (obr. 2) relativního zastoupení monomerních jednotek a oligomerů, proanthokyanidinů zcela jasně odlišily odrůdy chmele, a to i z pohledu genetické příbuznosti odrůd. České odrůdy s podílem ŽPČ v genomu se od tohoto tradičního chmele odlišují méně nežli odrůdy vzdálené. Geneticky vzdálené jsou odrůdy Kazbek a Agnus, které se řadí do skupiny amerických chmelů (Atlas, 2012). Kazbek má v původu plané kavkazské chmele, Agnus odrůdy ŽPČ, Sládek, Bor, Fuggle a Northern Brewer. Bližší ŽPČ jsou odrůdy chmele Sládek a Premiant. Obě tyto odrůdy mají v původu významný podíl ŽPČ. Je zřejmé, že genetický původ chmele koresponduje s chemotaxonomickým profilem proanthokyanidinů chmele. Výsledky získané novou metodou plně potvrdily závěry předchozí studie (Olšovská et al., 2013).

Obr. 2 Klastrová analýza. Odrůdová specifi ta chmele (Žatecký poloraný červeňák = Saaz) v závislosti na chemickém profilu proanthokyanidinů

5 ZÁVĚR

Společně se zdokonalující analytickou instrumentací došlo během posledních desetiletí k významným objevům v oblasti odrůdové specificity chmele. Jak metody chemotaxonomické, tak metody genetické jsou již na tak vysoké úrovni, že lze v současné době s velkou pravděpodobností určit původ chmelové odrůdy nebo prokázat falzifikát. Obě skupiny metod mají své výhody. Proto je ideální obě metody kombinovat, pokud to okolnosti, jako množství vzorku, dostupnost instrumentace a v neposlední řadě finanční prostředky, umožňují.