Rostoucí význam chromatografie spojené s tandemovou hmotnostní spektrometrií

Zeptejte se kteréhokoli analytického chemika, která kombinovaná analytická technika se během posledního desetiletí stala nepostradatelnou, a odpověď bude téměř vždy stejná: chromatografie spojená s tandemovou hmotnostní spektrometrií. Ať už jde o LC–MS/MS používanou ke studiu metabolického osudu nového biologického léčiva, nebo o GC–MS/MS umožňující stanovení per- a polyfluoroalkylových sloučenin (PFAS) v komunální vodě až na koncentrace pod 1 ppt, spojení chromatografické separace s vysokou selektivitou tandemové hmotnostní spektrometrie se stalo základní analytickou metodou prakticky ve všech regulovaných odvětvích.

V následujícím textu se podíváme na hlavní faktory, které tento trend pohánějí – od rozvoje biofarmaceutického průmyslu a zpřísňujících se požadavků na analýzu PFAS přes automatizaci založenou na umělé inteligenci až po návrat farmaceutické výroby do domovských zemí – a ukážeme, jaký dopad mají na laboratoře zajišťující přípravu vzorků a analytické pracovní postupy.

Biofarmacie: motor rostoucí poptávky po LC–MS/MS

Agonisté receptoru GLP-1 a metabolomická zlatá horečka

Explozivní komerční i vědecký zájem o agonisty receptoru GLP-1 – semaglutid a další peptidová léčiva určená k léčbě diabetu a obezity – výrazně zvýšil nároky na analytické platformy využívající tandemovou hmotnostní spektrometrii. Programy vývoje léčiv vyžadují přesnou kvantifikaci peptidových kandidátů i endogenních biomarkerů v komplexních biologických matricích. Tyto pracovní postupy využívají vysoce citlivou LC–MS/MS pro farmakokinetické studie, hodnocení obsazenosti receptorů a metabolomickou charakterizaci. Metabolomika je navíc považována za nejrychleji rostoucí aplikační oblast hmotnostní spektrometrie, a to mimo jiné díky svému stále významnějšímu uplatnění při screeningu nádorových onemocnění, objevování biomarkerů a výzkumu metabolických chorob.

V poslední době věnuji studiu léčiv ze skupiny GLP-1 více času, protože jde o téma, které posluchače podcastu Concentrating on Chromatography zajímá nejvíce. Přesto mě dnes ráno při snídani překvapilo, když jsem na CNBC četl, že jeden z osmi Američanů v současnosti užívá některý z těchto přípravků, například Ozempic.

Konjugáty protilátek s léčivy a genová terapie: složitost v každé fázi

Rychlý rozvoj konjugátů protilátek s léčivy (ADC) a genových terapií přinesl zcela novou úroveň analytické složitosti. ADC spojují cílovou specificitu monoklonálních protilátek s cytotoxickým účinkem nízkomolekulárních léčiv. Charakterizace chemie linkeru, stanovení poměru léčiva k protilátce (DAR) i hodnocení stability konjugátu proto vyžadují vysokorozlišovací LC–MS/MS ve všech fázích vývoje – od prvotního výzkumu až po výstupní kontrolu kvality před uvolněním šarže. Stejně přísnou charakterizaci nečistot, agregátů i poměru prázdných a plných kapsid vyžadují také vektory používané v genové terapii.

To vytváří přímou potřebu koncentračních metod s minimálními ztrátami způsobenými zakoncentrováním a vysokou výtěžností, které zachovávají labilní struktury proteinů i integritu vzorků před jejich nástřikem do systému LC–MS/MS. Stále větší význam proto získávají pracovní postupy využívající zakoncentrování proudem dusíku, které omezují oxidační stres a současně udržují vzorek při kontrolované teplotě.

Precizní medicína a integrace multiomických přístupů

Přechod k precizní medicíně urychlil zavádění vysokokapacitních platforem hmotnostní spektrometrie umožňujících současnou analýzu velkého počtu analytů. Proteomické, metabolomické a lipidomické pracovní postupy stále častěji využívají jedinou analytickou platformu – tandemovou hmotnostní spektrometrii – a vytvářejí datové soubory takového rozsahu a složitosti, které byly ještě před deseti lety nepředstavitelné.

Je třeba zdůraznit, že trojitý kvadrupól má v kvantitativních cílených analýzách stále nezastupitelné místo. Současně však rychle roste význam hybridních platforem Orbitrap a Q–TOF, protože výzkumníci stále častěji požadují měření přesné hmotnosti v režimu full scan pro necílené analýzy.

Environmentální regulace: Požadavky na analýzu PFAS podporují rozšiřování LC–MS/MS

Význam environmentálních analýz si uvědomuje každý, bez ohledu na to, zda je chemikem. Rostoucí požadavky Americké agentury pro ochranu životního prostředí (EPA) i evropských regulačních orgánů na analýzu PFAS – „věčných chemikálií“, jejichž mimořádná perzistence v životním prostředí odpovídá obtížnosti jejich stanovení ve stopových koncentracích – vedly k rychlému rozšiřování infrastruktury LC–MS/MS, které je motivováno především snahou splnit regulatorní požadavky.

Regulační rámec, který by chemici měli znát

EPA stanovila soubor metod založených na LC–MS/MS jako analytický standard pro stanovení PFAS ve vodných i pevných matricích.

• Metoda EPA 533: Extrakce na pevné fázi se slabou aniontovou výměnou (WAX-SPE) v kombinaci s LC–MS/MS; zahrnuje 25 PFAS včetně sloučenin s krátkým řetězcem v pitné vodě.
• Metoda EPA 537.1: Extrakce na pevné fázi s reverzní fází (RP-SPE) následovaná LC–MS/MS; zahrnuje 18 PFAS včetně sloučeniny GenX s detekčními limity v řádu jednotek ng/L.
• Metoda EPA 8327: LC–MS/MS pro stanovení vybraných PFAS v připravených extraktech vodných a pevných matric.
• Návrh metody EPA 1633: Nově se prosazující standard pro stanovení PFAS ve vodách, pevných matricích, čistírenských kalech a biologických tkáních, umožňující kvantifikaci až 40 PFAS.

Všechny tyto metody určují jako požadovanou nebo doporučenou analytickou techniku LC–MS/MS, konkrétně kapalinovou chromatografii spojenou s trojitým kvadrupólem nebo systémem typu tandem-in-time, pracujícím v režimu negativní elektrosprejové ionizace s MRM. Analýza PFAS je ve své podstatě doménou LC–MS/MS.

Příprava vzorků jako limitující faktor

Chemici, kteří pracují s metodami pro stanovení PFAS, dobře znají specifické nároky, které tyto postupy kladou na přípravu vzorků. Všudypřítomnost PFAS v laboratorních materiálech – například v PTFE hadičkách, některých SPE sorbentech nebo běžném laboratorním vybavení – znamená, že kontrola kontaminace slepých vzorků je z analytického hlediska stejně náročná jako samotná detekce analytů. Metoda EPA 537.1 vyžaduje extrakci přibližně 250 ml vzorku a jeho následnou rekonstituci do pouhého 1 ml rozpouštědla, čímž vzniká koncentrační faktor 250 : 1, který dokáže odhalit i stopovou kontaminaci vzniklou během zpracování vzorku. Zařazení tzv. delay column mezi LC čerpadlo a autosampler za účelem eliminace interferencí pocházejících z pozadí přístroje je dnes již standardní praxí.

Právě zde se naplno uplatňují robustní systémy pro zakoncentrování vzorků proudem inertního dusíku. Pracovní postupy pro analýzu PFAS využívající tento způsob zakoncentrování extraktů před rekonstitucí těží z použití materiálů bez PTFE a dalších fluoropolymerů, které mohou být zdrojem nežádoucího PFAS pozadí. Právě na tento aspekt klade společnost Organomation důraz při návrhu svých koncentračních systémů.

Analytická komunita se navíc posouvá za hranice cílené analýzy PFAS. HRAM využívající technologii Orbitrap ve spojení s necílenými screeningovými pracovními postupy se stále více prosazuje při identifikaci více než 5 000 dosud katalogizovaných sloučenin PFAS i nových struktur, které jsou průběžně objevovány. Zatímco LC–MS/MS zůstává zlatým standardem pro kvantitativní analýzu, HRAM rozšiřuje analytické možnosti o necílenou identifikaci nových sloučenin.

Technologické trendy měnící pracovní postupy LC–MS/MS

Umělá inteligence a automatizovaná interpretace dat

Datové soubory generované moderními platformami tandemové hmotnostní spektrometrie – zejména v omických aplikacích – jsou příliš rozsáhlé a komplexní na to, aby je bylo možné efektivně vyhodnocovat pouze manuálně. Spektrální dekonvoluce využívající umělou inteligenci, automatizovaná integrace píků i generování hypotéz s podporou AI jsou dnes běžnou součástí softwarových platforem dodávaných s nejmodernějšími přístroji. Příkladem tohoto trendu je akvizice softwaru ACIES od společnosti Virtual Control firmou Agilent, jejímž cílem bylo automatizovat zpracování dat z LC–MS a GC–MS.

Pro vedoucí laboratoří znamená integrace umělé inteligence možnost provozovat vysoce výkonné pracovní postupy pro stanovení více analytů i s menšími specializovanými týmy. Současně však klade ještě vyšší nároky na reprodukovatelnost přípravy vzorků, protože algoritmická interpretace dokáže zvýraznit i drobné odchylky vzniklé v předchozích fázích analytického postupu.

Online propojení SPE a „chromatografie bez hranic“

Významným trendem je integrace extrakce na pevné fázi přímo do průtokové cesty systému HPLC – tzv. online propojení SPE–HPLC. Systémy, které kombinují extrakci a chromatografickou separaci v jediném analytickém systému, omezují ruční manipulaci se vzorky, minimalizují riziko jejich ztráty nebo kontaminace a výrazně zvyšují kapacitu zpracování vzorků. U analytů přítomných ve velmi nízkých koncentracích umožňuje online SPE jejich zakoncentrování přímo na koloně, čehož se při tradiční offline přípravě dosahuje samotným zakoncentrováním.

Offline příprava vzorků – včetně zakoncentrování pod proudem dusíku za kontrolovaných podmínek, extrakce kapalina–kapalina a srážení proteinů – si však zachovává významné výhody z hlediska flexibility, práce s různými matricemi i možnosti zpracovávat objemy vzorků, které přesahují kapacitu online systémů. V dobře navržených analytických laboratořích se proto oba přístupy stále častěji vzájemně doplňují, než aby si konkurovaly.

Vysoce čistá rozpouštědla a referenční materiály

S tím, jak se detekční limity posouvají do oblasti femtogramů a analytické metody stanovené regulačními orgány vyžadují prokazatelnou kvalitu slepých vzorků, dostává se kvalita analytického spotřebního materiálu – rozpouštědel mobilní fáze, derivačních činidel i referenčních standardů – stále více do popředí zájmu. Validace metod v regulovaném prostředí dnes běžně vyžaduje, aby dodavatelé garantovali čistotu rozpouštědel na úrovni, která přímo ovlivňuje výkon přístroje.

Neustálá potřeba zakoncentrování vzorků

S tím, jak metody LC–MS/MS dosahují stále nižších detekčních limitů, přesouvají se stále vyšší nároky na analytický proces do přípravy vzorků. Kvalita zakoncentrování, čištění a rekonstituce vzorku před nástřikem rozhoduje o tom, zda lze teoretickou citlivost přístroje skutečně využít v praxi.

Zvláště významné jsou následující trendy:

• Charakterizace ADC a produktů genové terapie vyžaduje šetrné zakoncentrování při nízkých teplotách, které zachovává strukturu proteinů a zabraňuje jejich agregaci před analýzou LC–MS/MS. Preferovaným přístupem je zakoncentrování pod proudem dusíku za kontrolovaných podmínek.
• Analýza stopových množství PFAS vyžaduje koncentrační systémy vyrobené z materiálů inertních vůči PFAS a důslednou eliminaci fluoropolymerních materiálů ze všech částí systému, s nimiž vzorek přichází do styku.
• Vysokokapacitní farmaceutická kontrola kvality, podporovaná návratem farmaceutické výroby do zemí původu, vyžaduje možnost paralelního zpracování vzorků – vícepozicové koncentrátory, které udržují konstantní průtok i teplotu ve všech pozicích současně.
• Pracovní postupy v oblasti multiomiky a metabolomiky generují rozsáhlé série vzorků, které těží z automatizovaného zakoncentrování bez nutnosti obsluhy s programovatelným ukončením procesu, jež zajišťuje reprodukovatelné konečné objemy v rámci celé série.

Chromatografie spojená s tandemovou hmotnostní spektrometrií není pouze technologií na vzestupu – stává se nedílnou součástí analytických pracovních postupů ve všech hlavních regulovaných odvětvích. Současný rozvoj biofarmaceutik, zpřísňující se požadavky na analýzu PFAS, analýza dat s využitím umělé inteligence i návrat farmaceutické výroby do zemí původu vytvářejí dlouhodobou poptávku, která bude laboratoře nutit investovat nejen do instrumentace, ale také do celého ekosystému přípravy vzorků, jenž umožňuje plně využít potenciál těchto přístrojů.

Pro analytické chemiky z toho vyplývá jedno praktické ponaučení: s tím, jak citlivost hmotnostní spektrometrie neustále roste, stává se příprava vzorků hlavním limitujícím faktorem analytické metody. Ať už vyvíjíte novou metodu pro stanovení PFAS podle EPA 1633, charakterizujete poměr léčiva k protilátce u ADC nebo přes noc zpracováváte metabolomickou studii zahrnující 500 vzorků, spolehlivost a čistota pracovního postupu při zakoncentrování a čištění vzorků rozhodují o kvalitě všech následně získaných analytických dat.