Stanovení obsahu lipidů a zastoupení mastných kyselin v obilkách ječmene a ve sladu

Ke stanovení obsahu lipidů v obilce ječmene a ve sladu byla optimalizována moderní metoda extrakce na fluidním loži. Z vyextrahovaných lipidů bylo stanoveno zastoupení mastných kyselin v obilce ječmene a ve sladu.

Zastoupené mastné kyseliny byly stanoveny jako methylestery připravené transesterifikační reakcí. Vzniklé estery byly separovány metodou plynové chromatografie s plamenově ionizační detekcí na kapilární koloně SLB-IL 100.

1 ÚVOD

Hlavní surovinou pro výrobu sladu a následně piva na území České republiky od konce 19. století je jarní ječmen. Postupně se zvyšují a konkretizují požadavky na kvalitu sladovnického ječmene.

Stále ne zcela probádanou a doceněnou oblastí zůstává u obilek ječmene jejich enzymatická činnost. Enzym lipoxygenasa katalyzuje oxidaci nenasycených mastných kyselin s více dvojnými vazbami, obsahujícími cis-1,4-pentadienovou skupinu, molekulovým kyslíkem. Řetězovou reakcí vznikají přechodně peroxidy nenasycených mastných kyselin, které se štěpí na karbonylové sloučeniny (aldehydy, ketony) nebo mastné kyseliny s krátkými řetězci. Vytvářejí se tím sloučeniny s charakteristickými vůněmi a chutěmi. Mezi substráty enzymu lipoxygenasy patří nutričně významné esenciální mastné kyseliny linolová, linolenová a arachidonová. Mohou být oxidovány i acylglyceroly a další estery zmíněných mastných kyselin.

Základní složkou podílející se na žluklé chuti v uskladněném pivu je aldehyd trans-2-nonenal. Mechanismus vytvoření trans-2-nonenalu v pivu je enzymatická nebo neenzymatická oxidace tuků a oxidace volných mastných kyselin (obr. 1), kde svou roli sehrává enzym lipoxygenasa (1, 2).

Obr. 1 Schéma metabolismu dienových mastných kyselin (3)

Vzhledem k tomu, že mastné kyseliny obsažené v obilce ječmene a následně ve sladu mohou být zdrojem mnohých senzoricky aktivních látek v pivu, bylo nutné zavést a optimalizovat stanovení tuků a mastných kyselin ve výchozích surovinách.

Obsah lipidů byl stanoven pomocí moderní metody extrakce na fluidním loži. Pro analýzu zastoupení mastných kyselin byly porovnávány dvě polární kapilární kolony Supelcowax a SLB-IL 100.

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

2.1 Použité chemikálie a standardy

Petrolether – Lach-Net, s. r.o., ČR; izooktan – Sigma-Aldrich, USA; metanol – Sigma-Aldrich, USA; KOH – ML Chemica, ČR; NaHSO4 – Sigma-Aldrich, USA; směsný standard methylesterů mastných kyselin – FAME mix 37 – Sigma-Aldrich, USA; helium – čistota 5.0; vodík – čistota 5.0; vzduch – čistota 4.5; dusík – čistota 4.5.

2.2 Materiál a přístroje

Materiál

Pro sledování obsahu lipidů a zastoupení mastných kyselin v intaktních obilkách ječmene a sladech bylo analyzováno celkem 40 vzorků. 20 odrůd ječmene a 20 sladů z nich vyrobených.

Přístroje

Laboratorní mlýnek na jemné mletí – Retsch, Německo; analytické váhy s přesností na 0,001 g – Mettler Toledo, USA; extraktor fexIKA® dive-in control – IKA, Německo; PC; vakuová rotační odparka – IKA, Německo; laboratorní sušárna – BMT, ČR; exsikátor – Simax, ČR; pipeta skleněná 5 ml – Qaulicator, ČR; automatická pipeta 200 ml – Hamilton, USA; odměrný válec 100 ml – Simax, ČR; zkumavky o objemu 10 ml se skleněnou zábrusovou zátkou; vialky pro head space a uzavírací kleště 2 ml – CRS, USA; plynový chromatograf Trace Ultra s FID detektorem – Thermo Scientific, USA; autosampler AS3000 – Thermo Scientific, USA; kapilární kolona SLB-IL 100 (60 m x 0,25 mm I.D., 0,25 mm) – Supelco, USA; kapilární kolona Supelcowax (60 m x 0,25 mm I.D., 0,25 mm) – Supelco, USA.

2.3 Stanovení obsahu lipidů

Do patrony extraktoru se naváží cca 5 g pomletého vzorku a poté se vzorek nechá automaticky extrahovat 60 ml petroléteru v 6 cyklech po dobu 2,5 hodiny. Po extrakci se zbylé rozpouštědlo odpaří na rotační vakuové odparce a po odpaření se baňka s vyextrahovaným tukem suší 2 hodiny při 105 °C v sušárně. Baňka se nechá vychladit v exsikátoru a zváží s přesností na 0,001 g. Výsledky obsahu lipidů se uvádí v procentech v sušině vzorku (relativní směrodatná odchylka – RSD 2,1%).

2.4 Stanovení zastoupení mastných kyselin

Vyextrahované triacylglyceroly se rozpustí v izooktanu a převedou na methylestery transesterifikací s methanolickým roztokem hydroxidu draselného (obr. 2). Vzniklé estery se identifikují metodou GC/MS (plynová chromatografie s hmotnostním detektorem) a stanovují metodou GC/FID (plynová chromatografie s plamenoionizačním detektorem).

Obr. 2 Rovnice esterifikační reakce

Do zkumavky se zábrusem se naváží 50 až 70 mg tuku. Po rozpuštění ve 4 ml izooktanu se přidá 200 ml metanolického roztoku KOH a zkumavka se uzavře. Směs se po dobu asi 30 sekund intenzivně protřepává. Do roztoku se přidá cca 1 g hydrogensíranu sodného a znovu se intenzivně třepe po dobu 15 sekund, aby se zneutralizoval hydroxid draselný. Po usazení soli se do 2ml vialky odebere horní izooktanová vrstva, která obsahuje methylestery mastných kyselin a použije se k chromatografické analýze. Výsledek se uvádí jako procentuální zastoupení jednotlivých mastných kyselin ve vzorku (RSD 9,0–15,2 %). Pro separaci jednotlivých vzniklých esterů mastných kyselin byly použity dvě kapilární chromatografické kolony Supelcowax a SLB-IL 100. Podmínky chromatografických analýz jsou uvedeny v tab. 1. Identifikace jednotlivých analytů byly ještě potvrzeny srovnáním se standardem FAME mix 37, jehož složení je uvedeno v tab. 2.

Tab. 1 Podmínky chromatografické analýzy

Tab. 2 Seznam mastných kyselin (methylestery) – standard FAME mix 37

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Pro stanovení obsahu lipidů v obilce ječmene a ve sladu byla zavedena a optimalizována metoda extrakce s použitím fluidního extraktoru fexIKA® dive-in control. Množství použitého extrakčního rozpouštědla a doba trvání jednoho cyklu byly zvoleny tak, aby při konci cyklu byl analyzovaný vzorek zcela ponořen v rozpouštědle a aby ve varné baňce zůstal dostatečný objem rozpouštědla. Počet cyklů extrakce byl optimalizován na základě množství vyextrahovaného tuku ze vzorku (obr.3). Pro extrakci bylo zvoleno 6 cyklů. Jak vyplývá z výsledků, po 4. cyklu extrakce již nedochází k nárůstu obsahu tuků. Zvolený počet 6 cyklů je tedy zcela dostatečný pro kvantitativní extrakci tuků z obilek ječmene a ze sladu.

Obr. 3 Závislost obsahu vyextrahovaného tuku na počtu cyklů extrakce

Optimalizovanou metodou extrakce byly stanoveny obsahy lipidů u vzorků 20 odrůd ječmene a 20 sladů z nich vyrobených. Výsledky obsahů lipidů pro jednotlivé odrůdy jsou uvedeny v tab. 3.

Tab. 3 Obsah lipidů v obilkách ječmene a ve sladu

Obsah tuků v analyzovaných vzorcích ječmene a sladu se pohyboval v rozmezí 1,3 až 2,5 % v sušině, což odpovídá běžným hodnotám obsahu tuků v obilce ječmene uváděných v literatuře (5).

Pro stanovení zastoupení mastných kyselin v obilce ječmene a ve sladu byly porovnávány dvě kapilární kolony Supelcowax a SLB-IL 100. Nejdříve byla metodika stanovení esterů mastných kyselin testována na standardu FAME mix 37. Výsledné chromatogramy na koloně SLB-IL 100 a Supelcowax jsou zobrazeny na obr. 4 a 5.

Obr. 4 Chromatogram standardu FAME mix 37 na koloně SLB-IL 100

Obr. 5 Chromatogram standardu FAME 37 mix na koloně Supelcowax

Kolona Supelcowax s polární stacionární fází (polyethylenglykol) je vhodná pro separaci nízkovroucích analytů a methylesterů mastných kyselin. Tato kolona je tepelně stabilní až do 250 °C. SLB-IL100 je nová kapilární kolona se silně polární stacionární fází a je vhodná k analýze methylesterů mastných kyselin. Tato kolona se vyznačuje jak dobrou tepelnou stabilitou (230 °C), tak vysokou stabilitou stacionární fáze. Kolona SLB-IL100 je polárnější než kolona Supelcowax a navíc umožňuje rozdělení cis / trans izomerů methylesterů mastných kyselin (obr. 6).

Obr. 6 Srovnání dělení cis-trans izomerů methylesterů mastných kyselin

Při porovnání chromatogramů separace směsného standardu je zřejmé, že kolona SLB-IL 100 vykazuje dokonalejší separaci jednotlivých analytů (obr. 4 a 5). Pro analýzu zastoupení mastných kyselin byla vybrána kolona SLB-IL 100 také proto, že je schopna rozlišit kyselinu olejovou a elaidovou (obr.6), z nichž pouze první byla zjištěna v obilce ječmene a ve sladu.

Zastoupení jednotlivých mastných kyselin bylo sledováno v tucích vyextrahovaných z 20 odrůd ječmene a ve sladech z nich vyrobených. Ve všech vzorcích obilek ječmene byly identifikovány a stanoveny: kyselina laurová (C12:0), myristová (C14:0), pentadekanová (C15:0), palmitová (C16:0), stearová (C18:0), olejová (C18:1c), linolová (C18:2), linolenová (C18:3), arachová (C20:0), eikosadienová (C20:2), behenová (C22:0), eruková (C22:1), trikosanová (C23:0), lignocerová (C24:0) a nervonová (C24:1) (tab. 4).

Tab. 4 Rozmezí zastoupení mastných kyselin v obilkách ječmene 20 odrůd a ve sladech z nich připravených (kolona SLB-IL 100)

4 ZÁVĚR

Lipidy v obilkách ječmene a ve sladu byly stanoveny optimalizovanou moderní metodou extrakce na fluidním loži.

Pro stanovení zastoupení mastných kyselin v obilce ječmene a ve sladu byla použita kapilární kolona SLB-IL 100, protože na rozdíl od kolony Supelcowax vykazuje dokonalejší separaci analytů při srovnatelné době analýzy.

Ve sladu byl zjištěn až desetinásobný pokles obsahu kyseliny olejové (C18:1c) způsobený pravděpodobně její autooxidací. Zastoupení ostatních mastných kyselin v obilce ječmene je velmi podobné profilu mastných kyselin ve sladu.