Untargeted Metabolomics Using Orbitrap-Based GC-MS

Význam tématu

Metabolomika zaměřená na neřízenou detekci malých molekul poskytuje hluboký vhled do biochemických změn v organismu. Ve forenzních aplikacích je klíčová pro přesné stanovení doby úmrtí na základě změn koncentrací metabolitů v tkáních.

Cíle a přehled studie

Studie si kladla za cíl vyvinout a optimalizovat komplexní workflow pro neřízenou metabolomiku využívající Orbitrap GC-MS. Jako model byl použit rozklad svalové tkáně krys v časovém intervalu čtyř dnů, s denními odběry vzorků a sledováním změn metabolitového profilu.

Použitá metodika a instrumentace

Analytický postup zahrnoval:

• Homogenizaci vzorků v poměru chloroform : methanol : voda
• Derivatizaci oximací s methoxyaminem a silylací s MSTFA + TMCS
• Separaci pomocí GC TRACE 1310 s kolonkou TraceGOLD TG-5SilMS (15 m × 0,25 mm × 0,25 μm)
• Detekci na hmotnostním spektrometru Q Exactive GC hybrid quadrupole-Orbitrap
• Režim elektronové ionizace full scan 50–750 m/z, rozlišení FWHM 60 000 při m/z 200, hmotnostní přesnost sub-ppm
• Zpracování dat v MSConvert, XCMS, MzMatch.R, následné univariantní vyhodnocení v IDEOM a multivariantní analýza v SIMCA

Hlavní výsledky a diskuse

V datech bylo detekováno 1193 shluků EI fragmentů, z nichž 272 vykazovalo statisticky významné změny (P < 0,05). Univariantní analýza odhalila časově závislé nárůsty aminokyselin (threonin, aspartát, methionin, glutamin, lysin) a biogenního aminu putrescinu. PLS-DA model jasně oddělil vzorky bez rozkladu od vzorků po 1 – 3 dnech, což potvrzuje potenciál metody pro rozlišení časových stádií post mortem.

Přínosy a praktické využití metody

Navržené workflow poskytuje robustní a vysoce selektivní přístup k neřízené metabolomice v komplexních vzorcích. Vysoké rozlišení, široký dynamický rozsah a přesná kvantifikace otevírají cestu pro forenzní odhad doby úmrtí, klinické metabolomické studie a QA/QC v biotechnologiích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další validace biomarkerů post mortem intervalu, rozšíření workflow o cílené MS/MS analýzy, plná automatizace přípravy vzorků a aplikace metodiky na lidské a jiné biologické matrice rozšíří uplatnění této technologie jak ve forenzní praxi, tak v biomedicínském výzkumu.

Závěr

Použití Orbitrap-based GC-MS v neřízené metabolomice umožňuje spolehlivou identifikaci a kvantifikaci stovek metabolitů v širokém dynamickém rozsahu. Vyvinutý workflow představuje efektivní nástroj pro forenzní stanovení doby úmrtí a pro komplexní biologické aplikace.

Reference

• ProteoWizard Page. http proteowizard sourceforge net pristupeno 22 4 2015
• Smith CA Want EJ Tong GC Abagyan R Siuzdak G XCMS Processing Mass Spectrometry Data for Metabolite Profiling Using Nonlinear Peak Alignment Matching and Identification Anal Chem 2006 78 3 779 787
• Scheltema RA Jankevics A Jansen RC Swertz MA Breitling R PeakML mzMatch File Format Java Library R Library and Tool Chain for Mass Spectrometry Data Analysis Anal Chem 2011 83 7 2786 2793
• Creek DJ Jankevics A Burgess KEV Breitling R Barrett MP IDEOM an excel interface for analysis of LC MS based metabolomics data Bioinformatics 2012 28 7 1048 1049
• SIMCA Page Umetrics Website pristupeno 22 4 2015