Analysis of Glycolysis Metabolites in Human Embryonic Stem Cells using GC-MS/MS

Význam tématu

Metabolomika umožňuje identifikovat biomarkery a popsat biochemické dráhy v lidských buňkách. Analýza metabolitů glykolýzy v lidských embryonálních kmenových buňkách přináší cenné informace pro výzkum vývojové biologie, onemocnění i farmakologii. Vysoká selektivita a citlivost GC-MS/MS rozšiřují možnosti detekce i v komplexních biologických matricích.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout a validovat MRM metodu pro detekci a kvantifikaci klíčových meziproduktů glykolýzy extrahovaných z lidských embryonálních kmenových buněk. Studie porovnává citlivost a opakovatelnost GC-MS/MS analýzy s konvenční jednokvadru­ pólovou technikou.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky: extrakty z buněk kultivovaných na miskách Ø 60 mm, derivatizované trimethylsilylací (TMS). Postup podle Shimadzu Journal vol. 2.

Podmínky analýzy:

• Systém: GCMS-TQ8040 (Shimadzu)
• Kolona: DB-5, 30 m × 0,25 mm I.D., film 1,0 µm
• Teplotní program: 100 °C (4 min) → 4 °C/min → 320 °C (8 min)
• Mód injekce: splitless, 1 µL při 280 °C
• Převodní teplota rozhraní: 280 °C, iontové zdroje: 200 °C
• Režim měření: MRM, lineární rychlost nosného plynu 39 cm/s, doba smyčky 0,3 s

Hlavní výsledky a diskuse

GC-MS/MS v režimu MRM umožnil detekci všech sledovaných metabolitů glykolýzy, včetně těch, které nebyly spolehlivě rozpoznány jednou kvadrupó­lovou technikou. MRM přístup zlepšil eliminaci interferencí i selektivitu analýzy. Opakovatelnost metody (n=4) vykázala u většiny sloučenin nízké relativní standardní odchylky (%RSD od 3,7 % do 14,7 %), pouze u některých fosforylovaných látek dosáhla vyšších hodnot (až 30 %).

Hlavní detekované metabolity:

• Pyruvát, laktát, fosfoenolpyruvát
• Glyceraldehyd-3-fosfát, dihydroxyaceton-fosfát
• 2- a 3-fosfoglyceráty, bisfosfoglycerát
• Fruktóza 6-fosfát, glukóza 6-fosfát

Přínosy a praktické využití metody

Implementace GC-MS/MS MRM přístupu

• rozšiřuje detekční rozsah metabolitů v komplexních biologických matricích,
• zvyšuje selektivitu a potlačuje matriční interferenční signály,
• zajišťuje reprodukovatelné kvantitativní výsledky vhodné pro biomarkerové studie, QA/QC i farmakologický výzkum.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozvíjení databází MRM metod pro širší spektrum metabolitů, integrace s dalšími technikami (LC-MS/MS, ion mobility) a automatizace přípravy vzorků. Vývoj softwaru pro pokročilou deconvoluci signálů a strojové učení přispěje k rychlejšímu objevu nových biomarkerů.

Závěr

Metoda GC-MS/MS v režimu MRM pro analýzu glykolytických metabolitů v lidských embryonálních kmenových buňkách prokázala vysokou citlivost, selektivitu a opakovatelnost. Přístup otevírá nové možnosti pro komplexní metabolomické studie a aplikace v biomedicínském výzkumu.

Reference

1. Shimadzu Journal vol. 2: Postupy extrakce a derivatizace metabolitů z buněk
2. LAAN-J-MS-E103: Analýza metabolitů v extraktu lidských embryonálních kmenových buněk jednou kvadrupólem