Guide to Biopharmaceutical Solutions —From Cell Line Optimization to Pharmacokinetics—

Význam tématu

Ve výrobě biofarmak představuje integrovaný přístup k optimalizaci buněčných linií, pěstování, separaci, charakterizaci, kontrole kvality a farmakokinetice klíč k efektivitě, průkaznosti a rychlosti vývoje nových léčiv. S rostoucí komplexitou makromolekul a přísnými regulačními požadavky je nutné uplatňovat vysoce citlivé, automatizované a prostorově úsporné analytické platformy, které sníží spotřebu vzorku i provozní náklady a současně zvýší reprodukovatelnost výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této publikace je představit řadu aplikačních poznámek a případových studií technologických řešení od společnosti Shimadzu pokrývajících všechny kroky biotechnologické výrobní dráhy: od kvantifikace nukleových kyselin v mikroobjemu přes sledování stopových i makrokomponent v kultivačních médiích až po detailní charakterizaci proteinů, glykanů, agregátů a stopových prvků. Každý blok workflow je obohacen o popis instrumentace, metodiky, klíčových parametrů a praktických příkladů použití.

Použitá metodika a instrumentace

Pro jednotlivé fáze byly nasazeny následující technologie:

• Spektrofotometrie UV-VIS (UV-1900i + TrayCell/Nano Stick, BioSpec-nano) pro mikroobjemovou kvantifikaci DNA/RNA i proteinů.
• Automatická mikrochipová elektroforéza (MCE-202 MultiNA) pro analýzu heteroduplexních zlomů DNA.
• Robotizované vybírání kolonií (CELL PICKER) pro tvorbu klonů a screenování buněčných linií.
• AAS (AA-7000F/AAC) pro běžnou i vysoce citlivou analýzu kovových stop ve wkultivačních médiích.
• UHPLC-MS/MS (Nexera X3 + LCMS-8060) se špičkovým UF iontovým zdrojem pro širokospektrální metabolitiku a profiling aminokyselin, vitamínů a nukleotidů.
• Automatizované zpracování vzorků C2MAP-2030 integrováno s LC-MS pro analýzu více než 95 metabolitů ve 20 min.
• Inertní LC systém & LH-40 (Prominence Inert + LH-40) pro sekvenční purifikaci, frakcionaci a SEC analýzu proteinů přímo z plazmy.
• Edmanova degradace (PPSQ-51A/53A) a MALDI-TOF MS (MALDImini-1, MALDI-8020) pro N-terminální sled sekvencí a identifikaci sialyl-isomerů.
• LC-2060 UHPLC a spektroskopie FTIR (IRTracer-100) pro detailní mapování peptidů a sled sekundárních struktur proteinů.
• Fluorescenční detektory RF-20Axs a glykanové profilování HPLC pro kvantifikaci PA-/2-AB glykosidů.
• Dynamická analýza částic (Aggregates Sizer TC, iSpect DIA-10) pro měření agregátů 0,1–10 µm.
• DSC-60 Plus pro termální denaturaci proteinů a sled stability v roztocích i při zmrazování.
• ICP-MS (ICPMS-2030) dle ICH Q3D pro kontrolu elementárních nečistot s mini-torch plasmou.
• Přesná kvantifikace mAb v krvi (nSMOL BA Kit + LCMS-8050/8060/9030, Nexera Mikros) specifi ckými Fab-fragmenty.
• Metabolomika GC-MS/MS (GCMS-TQ8040 NX) a LC-MS/MS pro komplexní profil volných mastných kyselin, organických kyselin, cukrů, aminokyselin i nukleotidů.
• Profilování volných těkavých metabolitů (HS-20 Trap + GCMS-QP2020 NX, GC-2030/SCD-2030) pro biomarkery střevního mikrobiomu a vzorků biologických tekutin.
• Benchtop MALDI-TOF (MALDI-8020) pro rychlé proteomické a lipidomické fingerprinty buněčných kultur a exozomů.

Hlavní výsledky a diskuse

Každá metoda prokázala vysokou linearitu, reprodukovatelnost i citlivost:

• UV-VIS mikroobjemy 0,7 µL i 2 µL s R2 > 0,999 pro DNA, proteiny.
• AAS provedení stopových kovů ve wkultivačních médiích v rozsazích ppb–ppm s recoveries 90–110 %.
• UHPLC-MS metabolitů sekvence 125 sloučenin za 20 min s CV < 5 %.
• Edman + MALDI-ISD pro sekvenování cyclic peptide BNP a IgG s přesností < 20 ppm.
• Flow imaging a laser difrakce pro kvantifikaci zbytkových částic a agregátů
    (0,1–10 µm) v reálném čase pod mechanickým a teplotním stresem.
• DSC hodnotila Tm proteinů ve 2 % až 10 % roztocích, odhalila pH-závislé posuny stability.
• nSMOL bioanalýza Fab-specifických mAb fragmentů v krvi: LLOQ 0,06 µg/mL při přesnosti ≥ 85 %.
• ICP-MS 24 elementů dle Q3D v tabletách: detekce na úrovni 10–6 g/g, recoveries 95–105 %.
• GC-MS/MS a LC-MS/MS kombinace pro kompletní metabolomickou charakterizaci střevních výtahů: > 170 detekovaných sloučenin včetně těkavých, organických i polárních.
• Profilování exozomů a buněčných sloučenin MALDI-TOF: rozlišení rezistentních i senzitivních fenotypů rakovinových buněk.

Přínosy a praktické využití metody

Nasazené platformy přinášejí:

• Minimální množství vzorku (µL až stovky µL).
• Automatizaci workflow a vysokou propustnost dat (dny → hodiny → minuty).
• Snížení provozních nákladů díky mini-torch plasmě, dlouhé životnosti lamp, nízkým spotřebám plynů.
• Vyšší citlivost a selektivitu (MRM, ISD, SCD, dynamic imaging).
• Komplexní datový management (LabSolutions, eMSTAT, SIMCA) s podporou 21 CFR Part 11.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávaný rozvoj přinese:

• Further automatizované end-to-end procesy s on-line monitoringem kultivace a purifikace.
• Miniaturizaci a integraci více metod (multi-omics) v kompaktních modulech.
• Využití umělé inteligence a pokročilého strojového učení pro prediktivní kontrolu kvality.
• Real-time analytické senzory pro kontrolu kritických procesních parametrů (PAT).
• Rozšíření bezproblémové integrace dat mezi výrobním provozem a klinickými studiemi.

Závěr

Prezentovaný soubor instrumentálních a metodických řešení umožňuje komplexní a citlivou analýzu od optimalizace buněčných linií až po kvantifikaci mAb v pacientské krvi. Využití automatizace a špičkových detekčních technik zkracuje čas vývoje, snižuje náklady a zajišťuje vysokou kvalitu a reprodukovatelnost výsledků, což je klíčové pro moderní bioprodukci a farmakokinetiku.

Reference

• Shimadzu Application News A634: Direct Analysis of Metallic Elements in Cell Culture Medium by AAS.
• Matsumoto M. et al., Scientific Reports 2:223 (2012) – Metabolomic analysis of intestinal bacteria.
• Iwamoto N. et al., Analyst (2013) a Anal Methods (2015) – nSMOL quantitative bioanalysis.
• Nishikaze T. et al., Anal Chem 89:2353 (2017) – SALSA úprava sialových kyselin pro MALDI.
• Stübiger G. et al., Analytical Chemistry 90:13178 (2018) – MALDI-8020 profiling exozomů.