Guide to Biopharmaceutical Solutions — From Cell Line Optimization to Pharmacokinetics —

Význam tématu

Biotechnologická výroba monoklonálních protilátek a dalších biofarmaceutik vyžaduje komplexní a spolehlivé analytické postupy. Od optimalizace buněčných linií přes kultivaci a purifikaci po detailní charakterizaci a studium stability až po farmakokinetické hodnocení—každý krok musí být podpořen přesnými, citlivými a rychlými metodami.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem shrnutí je představit přehled řešení navržených pro biofarmaceutické pracovní postupy, včetně:

• Optimalizace buněčných linií
• Kvantifikace nukleových kyselin a proteinů
• Elektroforézy DNA/RNA a automatizovaného výběru kolonií
• Monitorování složení kultivačních médií
• Chromatografické a hmotnostně spektrometrické metody pro purifikaci a analýzu
• Vyhodnocení struktury proteinů, glykosylací a agregátů
• Řízení kovových a dalších nečistot dle ICH Q3D
• Farmakokinetické stanovení protilátek v biologických matricích

Použitá metodika a instrumentace

Souhrn hlavních technik a přístrojů:

• UV/VIS spektrofotometrie (UV-1900i, BioSpec-nano)
• Automatizovaná mikrochipová elektroforéza (MultiNA)
• Automatizované vybírání kolonií (CELL PICKER)
• AAS pro stopové kovy (AA-7000/AAC)
• UHPLC-MS/MS pro metabolity a biomolekuly (LCMS-8060, LCMS-8050, LCMS-8040)
• Automatická příprava vzorků (C2MAP-2030)
• Inertní HPLC pro purifikaci protilátek (Prominence Inert LC + LH-40)
• Edmanova degradace a MALDI-TOF pro sekvenování (PPSQ-51A/53A, MALDI-8020, MALDImini-1)
• Charakterizace agregátů a částic (Aggregates Sizer, iSpect DIA-10)
• Diferenciální skenovací kalorimetrie (DSC-60 Plus)
• FT-IR a spektrofluorimetrie (IRTracer-100, RF-20Axs)
• ICP-MS pro kontrolu kovových nečistot (ICPMS-2030)
• nSMOL enzymatická příprava pro LC-MS/MS kvantifikaci protilátek
• Micro-flow LC-MS systémy pro vyšší citlivost (Nexera Mikros)
• Volatilní profily plynů (HS-20 + GC-MS, GC-SCD)
• Malé vials a analytické váhy pro manipulaci s malými objemy (TORAST-H, AP series)

Hlavní výsledky a diskuse

Implementace představených řešení vedla k:

• Kvantifikaci nukleových kyselin a proteinů v řádu jednotek mikrolitrů s nízkým carryover
• Automatizované elektroforéze a výběru buněk se zvýšenou reprodukovatelností
• Monitorování stopových kovů a metabolit v kultivačním médiu bez komplikovaných příprav
• Přesné stanovení glykosylací a aminokyselinového složení proteinů
• Detekci a kvantifikaci subvizibilních agregátů v reálném čase při kontrolované teplotě
• Ověření stability proteinů termickou analýzou a FT-IR spektroskopií
• Dosažení nízkých detekčních limitů pro kovové nečistoty dle ICH Q3D
• Kvantifikaci monoklonálních protilátek v biologických matricích od 0,007 do 250 µg/mL

Přínosy a praktické využití metody

Navržené systémy poskytují:

• End-to-end automatizaci a zkrácení doby analýzy
• Vysokou citlivost, linearitu a přesnost v širokém rozsahu koncentrací
• Snížení objemu vzorků a reagencií, snížení provozních nákladů
• Možnost provozu v biopros­tředí díky inertním a PEEK materiálům
• Kompatibilitu s GLP a FDA 21 CFR Part 11 díky integrovanému softwaru pro správu dat

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané novinky a směry vývoje:

• Další miniaturizace a zvýšení automatizace laboratoří
• Integrace strojového učení pro rychlou analýzu a interpretaci dat
• Víceúrovňové multi-omic přístupy spojující genomiku, proteomiku a metabolomiku
• Real-time monitorování bioreaktorů a online QC
• Rozšíření kitů pro různé formy glykosylací či post-translační modifikace

Závěr

Prezentované řešení pokrývají kompletní biofarmaceutický workflow od výběru a optimalizace buněčných linií přes kultivaci, purifikaci a detailní charakterizaci až po PK/PD analýzy. Díky pokročilé instrumentaci a automatizaci dochází ke zrychlení vývoje, zlepšení reprodukovatelnosti a splnění přísných regulačních požadavků.

Reference

1) Inn H. Yuk et al. Direct Analysis of Metallic Elements in Cell Culture Medium by AAS. Biotechnology Progress 30, 429–442 (2014).
2) Prabhu S. et al. Analysis of Trace Metals in Culture Supernatant. Appl. Microbiol. Biotechnol. 102, 5989–5999 (2018).
3) Shimadzu Application News A634, 2016.
4) Z. Sun et al. Holistic Profiling of CHO Cell Culture Media. Biologicals 61, 144–151 (2019).
5) J. Kovacs-Nolan, J. Agric. Food Chem. 53, 8421–8431 (2005).
6) Y. Mine, J. Agric. Food Chem. 38, 2122–2125 (1990).
7) J. Kong, S. Yu. Acta Biochim. Biophys. Sin. 39, 549–559 (2007).
8) A. Kato, T. Takagi. J. Agric. Food Chem. 36, 1156–1159 (1988).
9) T. Nishikaze et al. Sialic Acid Linkage-Specific Alkylamidation. Anal. Chem. 89, 2353–2360 (2017).
10) H. Hanamatsu et al. MALDI ISD Profiling. Anal. Chem. 90, 13193–13199 (2018).
11) S. Uchiyama. Yakugaku Zasshi 138, 1503–1507 (2018).
12) K. M. et al. Subvisible Particle Analysis. J. Pharm. Sci. 108, 832–841 (2019).
13) ICH Q3D Guideline for Elemental Impurities (2015).
14) Supplement II to Japanese Pharmacopoeia 17 (2019).
15) N. Iwamoto et al. nSMOL Bioanalysis. Analyst (2013).
16) N. Iwamoto et al. nSMOL Method Extension. Anal. Methods (2015).
17) Shimadzu Application News C145A (2017).
18) M. Matsumoto et al. Gut Metabolome Analysis by CE–MS. Sci. Rep. 2, 223 (2012).
19) G. Stübiger et al. Proteomic Profiling via MALDI-TOF. Anal. Chem. 90, 13178–13182 (2018).
20) Shimadzu Product Manuals and Application Notes (2021).