ANALYTICKÉ METODY STUDIA CYTOKININŮ

Význam tématu

Rostlinné hormony cytokininy regulují klíčové procesy růstu, dělení buněk a senescence. Přirozeně se vyskytují v rostlinných pletivech ve velmi nízkých koncentracích (fmol–pmol·g⁻¹ čerstvé hmoty), což klade vysoké nároky na citlivost a selektivitu analytických metod. Spolehlivá identifikace a kvantifikace cytokininu je nezbytná pro studium jejich biosyntézy, metabolismu i fyziologické role.

Cíle a přehled studie

Článek systematicky porovnává hlavní analytické přístupy ke studiu cytokininu adeninového typu v rostlinných vzorcích. Zahrnuje extrakci, čistící postupy, biotesty, chromatografické techniky (HPLC, GC) a kombinace s hmotnostní spektrometrií (MS), stejně jako imunochemické metody. Hodnotí parametry citlivosti, selektivity, časové a finanční náročnosti i možnosti automatizace.

Použitá metodika a instrumentace

Pro extrakci se běžně používají methanol, ethanol, aceton a vícesložkové směsi (např. methanol–chloroform–kyselina mravenčí–voda). Pročištění zahrnuje frakcionaci kapalina–kapalina, SPE se speciálními hybridními sorbenty i kombinace se iontoměničovou a imunoafinitní chromatografií. Derivatizace pro GC/MS využívá trimethylsilylace, trifluoracetylační a permethylace, pro HPLC/MS se často používá předkolonová derivatizace propionáty.
Hlavní instrumentace:

• HPLC s reverzní fází a UV/diode array detektorem
• Kapilární HPLC (i.d. 0,3–2 mm) spojená s ESI-MS, APCI-MS nebo FAB-MS
• GC/MS s EI, CI a DCI detekcí
• Imunoanalytické techniky RIA, ELISA
• Imunoafinitní chromatografie (IAC)
• Kapilární zónová elektroforéza (CZE)
• Voltametrie na uhlíkových a rtuťových elektrodách

Hlavní výsledky a diskuse

Optimální metoda závisí na cíli analýzy: pro screening široké škály cytokininu u omezeného množství materiálu je nejvhodnější HPLC/MS nebo GC/MS s vysokou selektivitou a detekčními limity v femto–pikomolární oblasti. Pro sledování jednoho derivátu v přebytku stačí méně citlivá chromatografie s UV detekcí nebo biotesty. Imunochemické metody jsou levné, citlivé a snadno dostupné, ale vyžadují předchozí chromatografickou frakcionaci kvůli křížovým reaktivitám protilátek. Kombinace IAC a HPLC/MS přináší výbornou čistotu vzorků, vysokou obnovu (~85 %) a nízké detekční limity. Kapilární kolony a prekoncentrace na předkolonách umožňují analýzu i z několika stovek mg čerstvé hmoty.

Přínosy a praktické využití metody

Moderní kombinované metody umožňují:

• Identifikaci a kvantifikaci více než 20 cytokininu v jediném experimentu
• Studium biosyntézy pomocí deuterovaného značení in vivo
• Screening kultivarů modelových rostlin (Arabidopsis thaliana)
• Hpoměřování biologické aktivity pomocí biotestů (buněčná dělení, senescence)

Budoucí trendy a možnosti využití

Mezi perspektivní směry patří:

• Metabolické profilování (GC/MS/MS) pro současné sledování stovek metabolitů
• Další miniaturizace a automatizace SPE a kapilárních LC–MS
• Souběžné analýzy více skupin fytohormonů
• Vývoj vysoce specifických monoklonálních protilátek a nanotechnologií pro imunoanalýzy

Závěr

Analytické studie cytokininu vyžadují kombinaci účinné extrakce, selektivního čištění a citlivé detekce. GC/MS a HPLC/MS poskytují nejvyšší citlivost a selektivitu, immunochemické metody nabízejí příznivý poměr cena/výkon. Klíčovým krokem zůstává extrakce a přečištění vzorku, kde hybridní sorbenty a IAC přinášejí výrazné zjednodušení. Další rozvoj instrumentace a metod povede k rychlejšímu a širšímu využití v praxi i výzkumu.

Reference

1. Miller C. O., Skoog F., Von Saltza M. H., Strong F.: J. Am. Chem. Soc. 78, 1392 (1955).
2. Skoog F., Strong F. M., Miller C. O.: Science 148, 532 (1965).
3. Macháčková I.: Fyziologie rostlin, Academia, Praha 1998.
4. Crozier A., Moritz T.: Biochemistry and Molecular Biology of Plant Hormones, Elsevier, Amsterdam 1999.
5. Bieleski R. L.: Anal. Biochem. 9, 431 (1964).
6. Astot C., Doležal K., Moritz T., Sandberg G.: J. Mass Spectrom. 33, 892 (1998).
7. Pacáková V., Štulík K. et al.: J. Chromatogr., A 764, 331 (1997).
8. Dobrev P. I., Kamínek M.: J. Chromatogr., A 950, 21 (2002).
9. Nordström A.: osobní sdělení.
10. Holub J. et al.: Plant Growth Regul. 26, 109 (1998).
11. Hewett E. W., Warening P. F.: Planta 114, 119 (1973).
12. Van Staden J. et al.: S. Afr. J. Bot. 60, 293 (1994).
13. Hradecká D. et al.: Auxin and Cytokinin in Plant Development, Prague 1999, S84.
14. Doležal K. et al.: Plant Growth Regul. 36, 181 (2002).
15. Tarkowská D. et al.: Physiol. Plant. 117, 579 (2003).
16. Taverner E. et al.: Phytochemistry 51, 341 (1999).
17. Yang Y. Y. et al.: J. Plant Growth Regul. 12, 21 (1993).
18. Prinsen E. et al.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 9, 948 (1995).
19. Imbault N. et al.: Biol. Mass Spectrom. 22, 201 (1993).
20. Prinsen E. et al.: J. Chromatogr., A 826, 25 (1998).
21. Van Rhijn J. A. et al.: J. Chromatogr., A 929, 31 (2001).
22. Novák O. et al.: Anal. Chim. Acta 480, 207 (2003).
23. Astot C. et al.: J. Mass Spectrom. 35, 13 (2000).
24. Astot C. et al.: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14778 (2000).
25. Morris R. O.: Plant Physiol. 59, 1029 (1977).
26. Scott I. M. et al.: Planta 149, 472 (1980).
27. Most B. H. et al.: J. Chromatogr. 38, 136 (1968).
28. MacLeod J. K. et al.: J. Org. Chem. 41, 3959 (1976).
29. Ludewig M. et al.: J. Chromatogr. 243, 93 (1982).
30. Hocart C. H. et al.: Anal. Biochem. 153, 85 (1986).
31. Scott I. M., Horgan R.: Planta 161, 345 (1984).
32. Björkman P. O., Tillberg E.: Phytochem. Anal. 7, 57 (1996).
33. Hocart C. H. et al.: J. Chromatogr., A 811, 246 (1998).
34. Tay S. A. B. et al.: J. Plant Biochem. Biotechnol. 2, 105 (1993).
35. Price C. P., Newmann D. J.: Principles and Practice of Immunoassay, Stockton Press 1997.
36. Edwards R.: Immunoassay: An Introduction, William Heinemann 1985.
37. Weiler E. W.: Annu. Rev. Plant Physiol. 35, 85 (1984).
38. Morris B. A. et al.: Principles and Practice of Immunoassay, Academic Press 1988.
39. Gosling J. P., Reen D. J.: Immunotechnology, Portland Press 1993.
40. Price C. P. et al.: Anal. Biochem. 83, 632 (1977).
41. Hacker B. et al.: J. Immunol. 6, 1726 (1972).
42. Brandon D. L. et al.: Plant Physiol. 63, 82 (1979).
43. Khan S. A. et al.: Anal. Biochem. 83, 632 (1977).
44. Trione E. J. et al.: J. Plant Growth Regul. 4, 101 (1985).
45. Wang T. L. et al.: Phytochemistry 26, 2447 (1987).
46. Badenoch-Jones J. et al.: Plant Physiol. 75, 1117 (1984).
47. Maldiney R. et al.: J. Immunol. Methods 90, 151 (1986).
48. Hewett E. W. et al.: Plant Growth Regul. 36, 181 (2002).
49. MacDonald E. M. S. et al.: J. Chromatogr. 214, 101 (1981).
50. Hage D. S.: Clin. Chem. 45, 593 (1999).
51. Morris R. O. et al.: Plant Physiol. 95, 1156 (1991).
52. Nicander B. et al.: Planta 189, 312 (1993).
53. Ulvskov P. et al.: Planta 188, 70 (1992).
54. Barták P. et al.: J. Chromatogr., A 818, 231 (1998).
55. Barták P. et al.: J. Chromatogr., A 878, 249 (2000).
56. Hernández P. et al.: Electroanalysis 9, 235 (1997).
57. Blanco M. H. et al.: Electroanalysis 12, 147 (2000).
58. Blanco M. H. et al.: Fresenius’ J. Anal. Chem. 364, 254 (1999).
59. Tarkowská D. et al.: Collect. Czech. Chem. Commun. 68, 1076 (2003).
60. Glassbrook N. et al.: Nat. Biotechnol. 18, 1142 (2000).
61. Müller A. et al.: Planta 216, 44 (2002).
62. Birkemeyer C. et al.: J. Chromatogr., A 993, 89 (2003).