Exploring the biotechnological potential of endophytic fungi using online automated sample preparation GC-MS

Význam tématu

Endofytické houby jsou významným zdrojem bioaktivních sloučenin s potenciálem pro biotechnologické a farmaceutické aplikace. Metabolomika umožňuje detailní analýzu malých molekul, které odrážejí biochemickou aktivitu organismu, a tím poskytuje cenné informace o produkci metabolitů s antimikrobiálními, antifungálními či bioenergetickými vlastnostmi.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo využít automatizované online přípravy vzorků spojené s GC-MS a GC-Q-TOF analýzou k neřízenému metabolickému profilování tří druhů endofytických hub. Provedeno bylo 18 replikátních analýz s cílem identifikovat a semi-kvantifikovat unikátní metabolity jednotlivých kmenů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro robustní a reprodukovatelnou přípravu vzorků byla zavedena plně automatizovaná derivatizace MOX-TMS přímo na autosampleru s funkcí PrepAhead, která minimalizuje čas mezi přípravou a analýzou.

• Autosampler: GERSTEL MPS xt Dual Rail (10 µL a 250 µL stříkačky)
• Moduly: agitátor, vortexer, evaporační stanice, robotická centrifuga Anatune CF-200
• GC-MS (MSD): Agilent 7890 + 5975C EI Inert Source
• GC-Q-TOF: Agilent 7890 + 7200 Q-TOF s odnímatelným EI zdrojem

Postup:

1. Kultivace hub v půdě s vysokým obsahem dextrozy.
2. Omytí, zmrznutí, lyofilizace a odvážení cca 2 mg vzorku.
3. Derivatizace: 90 min methoximace (30 °C), poté 30 min silylace (37 °C).
4. Oddělení fází a přímá injekce (2 µL) do GC-MS.
5. Data zpracována v Agilent MassHunter (Qualitative, Unknown, Quantitative) a MPP pro statistiku.

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání TIC chromatogramů ukázalo vyšší citlivost Q-TOF analýzy oproti MSD. Celkový počet detekovaných komponent se pohyboval od 231 do 336 (MSD) a od 286 do 417 (Q-TOF), z toho po odečtení blanků zůstalo v průměru 20–30 relevantních sloučenin na vzorek.
Pomocí PCA i hierarchického seskupení se tři druhy hub a blanky jasně oddělily do samostatných clusterů. Vennovy diagramy a nástroj Find Unique Entities identifikovaly pro každý druh unikátní metabolity (21 pro druh 11, 15 pro druh 21, 24 pro druh 3).
Potvrzení entit proběhlo kontrolou ret. času, EIC a library match faktoru. Semi-kvantitativní evaluace pomocí kvantitativních metod ukázala u skupin 11 a 3 několik významně up-regulovaných sloučenin.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaná online derivatizace zvyšuje reprodukovatelnost analýz, eliminuje lidské chyby a minimalizuje degradační riziko čerstvě připravených vzorků. Tato robustní workflow je vhodná pro rozsáhlé neřízené metabolomické studie v akademickém i průmyslovém prostředí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj automatizace a propojení s LC-MS nebo hyphenovanými omickými technologiemi přispěje k hlubší charakterizaci metabolomů. Integrace pokročilé datové analýzy s využitím strojového učení umožní rychlejší objevy nových bioaktivních sloučenin a jejich aplikaci v potravinářství, zemědělství i farmaceutickém výzkumu.

Závěr

Studie prokázala efektivitu plně automatizované MOX-TMS derivatizace spojené s GC-MS/Q-TOF analýzou pro neřízené metabolomické profilování endofytických hub. Robustní příprava a pokročilá statistická vyhodnocení umožnila identifikovat a semi-kvantifikovat unikátní metabolity jednotlivých kmenů, což posiluje biotechnologický potenciál těchto mikroorganismů.

Reference

Literatura neuvedena v původním textu.