Extraction of THC, Hydroxy-THC and Carboxy-THC from Whole Blood Using ISOLUTE® SLE+ Prior to GC/MS Analysis

Význam tématu

V oblasti forenzní a klinické toxikologie je přesné stanovení zlomek kanabinoidů v plné krvi nezbytné pro posouzení expozice uživatelů a farmakokinetických studií. Efektivní příprava vzorku s vysokou selektivitou a reprodukovatelným výtěžkem minimalizuje vliv matrice a zlepšuje spolehlivost následné GC/MS analýzy.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované studie bylo vyvinout a optimalizovat postup podpůrné kapalinné extrakce (Supported Liquid Extraction, SLE+) pomocí komerční sorpční destičky ISOLUTE SLE+ pro izolaci tří hlavních kanabinoidních analyzátů (Δ9-THC, 11-hydroxy-Δ9-THC, 11-nor-9-karboxy-THC) z 1 mL vzorku plné krve. Po extrakci jsou analyzáty derivatizovány a stanoveny GC/MS metodou v režimu SIM.

Použitá metodika

Postup extrakce:

• Předúprava: Do 1,2 mL plné krve se přidá 0,4 mL vodného roztoku 0,1 % kyseliny mravenčí, promíchá se.
• Nabilí se 800 µL upraveného vzorku na destičku ISOLUTE SLE+ (kapacita 1 mL) a aplikuje se krátký pulz vakua nebo tlaku pro iniciaci sorpce, poté 5 minut absorpce.
• Eluce: Nejprve 3 mL MTBE pod gravitačním tokem (5 minut), poté 3 mL hexanu (5 minut), nakonec se zbývající solvent vytáhne krátkým vakuem nebo tlakem.
• Sušení: Odpaření extraktu ve vzdušném nebo dusíkovém proudu při 40 °C (SPE Dry nebo TurboVap).
• Derivatizace: Suchý zbytek se rekonstituuje v 40 μL ethylacetátu a 20 μL směsi BSTFA:TMCS (99:1), víří se 20 sekund, poté se inkubuje 25 minut na 70 °C a nechá vychladnout.

Použitá instrumentace

Pro separaci a detekci byl použit plynový chromatograf Agilent 7890A s kolonkou DB-5 (30 m × 0,25 mm × 0,25 μm), nosič helium 1,2 mL/min, injektor splitless při 250 °C, program teplot:

• 60 °C počátek, rampou 25 °C/min do 350 °C, držení 0,4 min.
• Post běh: backflush 2,4 minuty.

Detektor: Agilent 5975C MSD v režimu SIM s optimalizovanými ionty pro kvantifikaci i kvalifikaci a interními standardy izotopově značených derivátů (THC-D3, THC-OH-D3, THC-COOH-D3).

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizovaný SLE+ protokol dosáhl:

• Extrahovatelné výtěžky 72–83 % pro všechny analyzáty.
• Relativní směrodatné odchylky (RSD) pod 10 % (n=7).
• Kalibrační křivky lineární v rozsahu 1–150 ng/mL (r2 ≥ 0,999).
• Mezní kvantifikační limity (LLOQ): 1 ng/mL pro THC, 3 ng/mL pro THC-OH a THC-COOH.

Protokol zajišťuje čisté extrakty bez emulzí a významně zkracuje dobu přípravy vzorku ve srovnání s tradiční LLE.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí reprodukovatelnost a vysokou selektivitu pro forenzní, toxikologické i klinické aplikace. Jednoduchá manipulace s destičkami ISOLUTE SLE+ umožňuje snadnou integraci do automatizovaných linek a zvyšuje laboratorní průtoková kapacitu při udržení kvality výsledků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování zahrnuje:

• Rozšíření metody na další lipofilní látky a metabolity.
• Integraci s automatizovanými systémy pro vysokoprodukční analýzu.
• Využití nových sorpčních materiálů s vyšší selektivitou.
• Kombinaci SLE+ s hyphenovanými technikami (LC-MS/MS) pro kompletní profiling bioaktivních sloučenin.

Závěr

Implementace ISOLUTE SLE+ protokolu významně zjednodušuje a zefektivňuje extrakci Δ9-THC a jeho metabolitů z plné krve před GC/MS analýzou. Metoda dosahuje vysokých výtěžků, vynikající opakovatelnosti a nízkých mezních kvantifikačních hladin, což ji činí vhodnou pro požadavky forenzní a klinické laboratoře.

Reference

Biotage AB. Application Note AN840: Extraction of THC, Hydroxy-THC and Carboxy-THC from Whole Blood Using ISOLUTE SLE+ Prior to GC/MS Analysis. 2015.