Metabolomics of Carbon Fixing Mutants of Cyanobacteria by GC/Q-TOF

Význam tématu

Rostoucí poptávka po obnovitelné biomasě a palivech klade důraz na zvýšení efektivity fixace CO₂ fotosyntetickými mikroorganismy. Cyanobakterie Synechococcus elongatus představují perspektivní platformu pro biotechnologické využití, avšak jejich růst je často omezen pomalou rychlostí karboxylace. Metabolomické studie mutovaných kmenných variant pomáhají odhalit metabolické uzly, jejichž optimalizace může vést k efektivnějšímu využití CO₂ a rychlejší produkci biomasy.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo aplikovat neřízenou (untargeted) metabolomiku pomocí plynné chromatografie spojené s kvadrupól–časově-oflotovým hmotnostním spektrometrem (GC/Q-TOF) k charakterizaci kmenů S. elongatus s vyššími růstovými rychlostmi vzniklými náhodnou mutagenezí. Výsledky mají odhalit změny v metabolickém profilu a navrhnout klíčové biochemické dráhy vhodné pro další inženýrské zásahy.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika zahrnovala:

• Mutagenezi kmenů pomocí EMS a NTG a výběr variant s vyššími růstovými rychlostmi v atmosféře obohacené CO₂.
• Extrahování centrálních metabolitů metanol/chloroformovým protokolem, následné odpaření a dvojí derivatizaci (methoximace, silylace).
• Analýzu GC/Q-TOF (Agilent 7890 GC + 7200 series Q-TOF MS), dekonvoluci chromatogramu a identifikaci pomocí knihovny Agilent-Fiehn RTL.
• Statistické vyhodnocení dat: Principal Component Analysis (PCA), fold-change analýza, Volcano plot, neřízená a cílená analýza v softwaru Mass Profiler Professional (MPP).

Použitá instrumentace

• Plynné chromatografy Agilent 7890 se sloupci DB-5 MS UI (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm).
• Quadrupól-časově-oflotový hmotnostní spektrometr Agilent 7200 series (EI, m/z 50–600).
• Softwary Agilent MassHunter Quantitative Analysis a Mass Profiler Professional pro dekonvoluci a multivariační analýzu.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza pěti mutovaných kmenů (M2, M3, M4, M10, M12) odhalila:

• Všechny mutanty vykazují odlišný metabolický profil oproti divokému typu, zejména v úrovních organických kyselin, aminokyselin a cukrů fosfátů.
• Mutanty M2 a M12 vykazují nejvýraznější změny: zvýšené hladiny ribulóza-5-fosfátu a dalších mezilehlých produktů CBB cyklu, což naznačuje zlepšenou fixaci CO₂.
• PCA potvrdila jasné oddělení kmenů podle metabolomického otisku, Volcano plot a FCA ukázaly statisticky významné fold-change pro klíčové metabolity.
• Cílená analýza dráhovým přístupem poukázala na úpravy v TCA cyklu, glykolýze, biosyntéze mastných kyselin a dráze purinů.

Přínosy a praktické využití metody

Neřízená metabolomika poskytuje komplexní přehled o biochemických změnách v mutantech, což umožňuje:

• Identifikaci metabolických úzkých míst omezujících růst a fixaci CO₂.
• Datově podloženou volbu genů či enzymů pro cílenou inženýrskou modifikaci.
• Rychlejší vývoj efektivních kmenů pro produkci biopaliv a bio-based chemikálií.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další směřování výzkumu může zahrnovat:

• Integraci genomiky, transkriptomiky a proteomiky s metabolomikou pro holistický pohled na mutace.
• Vyšlechtění vícečetných mutací cílených v několika drahách současně pomocí pokročilých inženýrských nástrojů.
• Nasazení kontinuálních mikrofluidních bioreaktorů pro řízené evoluční experimenty a real-time metabolomické monitorování.
• Využití umělé inteligence pro predikci nejvhodnějších mutací na základě rozsáhlých metabolomických dat.

Závěr

Studie potvrzuje, že neřízená metabolomika GC/Q-TOF je účinným nástrojem pro objevování klíčových metabolických změn v cyanobakteriálních mutatech. Identifikace zvýšených hladin meziproduktů CBB a TCA cyklů poskytuje strategii pro budoucí genové úpravy s cílem zvýšit fixaci CO₂ a růstovou efektivitu, což je klíčové pro průmyslové využití fotosyntetických mikroorganismů.

Reference

• Chung D.-H., Rabinovitch-Deere C., Aronova S., Atsumi S. Metabolomics of Carbon Fixing Mutants of Cyanobacteria by GC/Q-TOF. ASMS 2013, TP 419.