Derivatization Procedure and Negative Chemical Ionization GC/MS/MS Conditions for the Analysis of Steroidal Analogs

Význam tématu

Steroidní sloučeniny představují širokou třídu biologicky aktivních molekul, které slouží jako klíčové biomarkery v klinické diagnostice, forenzní toxikologii i environmentálním monitoringu. Jejich přesné stanovení v nízkých koncentracích je zásadní pro sledování onemocnění (např. hormonální dysbalance v nádorových i kardiovaskulárních onemocněních), hodnocení expozice škodlivým látkám a studium biologického účinku kontaminant.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem této application note je popsat chemickou derivatizační proceduru a optimalizované podmínky pro negativní chemickou ionizaci v GC/MS/MS, která umožňuje vysoce citlivou a selektivní analýzu vybraných estrogenů a androgenů. Studie demonstruje kroky přípravy vzorku, volbu derivatizačních činidel a nastavení instrumentace pro dosažení limitů detekce v řádu pg/mL.

Použitá metodika a instrumentace

Derivatizace probíhá ve dvou krocích:

• Esterifikace fenolů a alkoholů pentafluorbenzoylchloridem v anhydróním etylacetátu za přítomnosti pyridinu.
• Oximace ketonů pentafluorbenzoylhydroxylaminem v pyridinu.

Reakce probíhají při 60 °C po 30 minut, následuje extrakce, odpaření a rekapitulace v nepolárním rozpouštědle.
Pro chromatografii je použita sestava Agilent 7890A GC s dvojitou kolonnou DB-17ht (1 m předkolona + 15 m analytická) a backflush konfigurací Purged Ultimate Union. GC podmínky zahrnují pulsed splitless injekci, postupné programování teploty od 205 do 305 °C a konstantní tok helia.
Spektrometrie je realizována na Agilent 7000 Triple Quadrupole GC/MS v režimu negativní chemické ionizace (NCI) s metanem jako reagenčním plynem. Měřicí režim je vybraný reakční monitoring (SRM) s optimalizovanými přechody a kolizními energiemi pro každý derivát.

Hlavní výsledky a diskuse

Pro estradiol (E2) byla určena mez detekce (IDL) 1,1 pg/mL při 99% spolehlivosti, průměrné S/N > 500 a relativní standardní odchylka plochy 3,7 % (8 replik). Kalibrační závislost v rozsahu 0,5–250 pg/mL vykázala R2 = 0,998, což potvrzuje vynikající linearitu. Intrarun backflush zkrátil dobu analýzy, zlepšil retence i přesnost limitů a prodloužil životnost kolony a iontového zdroje.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí:

• Extrémně nízké limity detekce v pg/mL.
• Vysokou selektivitu díky SRM na triple quadrupole.
• Širokou použitelnost v séru, plasmě, odpadních vodách, půdách či bio-solidech.
• Robustní běh s minimální kontaminací a dlouhodobou stabilitou.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření metody na vysokoprůchodové screeningové platformy, automatizaci derivatizace a aplikaci v monitoringu nových steroidních kontaminant v ekosystémech. Další výzvou je adaptace na materiály s náročnou matricí a integrace s dalšími detekčními technikami.

Závěr

Popsaná chemická derivatizace spolu s NCI-GC/MS/MS poskytuje citlivou a selektivní analýzu steroidních analogů s detekčními limity ~1 pg/mL. Metoda je robustní, reprodukovatelná a použitelná napříč klinickými, forenzními i environmentálními aplikacemi.

Reference

1. M. Churley, A. Macherone, R. White, Analysis of estrone and 17b-estradiol in ground water by GC-NCI-MS/MS, 59th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Denver, CO, 5–8 June 2011.
2. A. Macherone, M. Churley, R. White, Ultra-low Detection of Estrogenic Compounds by GC-NCI/MS/MS, LC/GC Special Issues, Advanstar Communications, Inc., 2010.
3. G. Wells, H. Prest, Why use signal-to-noise as a measure of MS performance when it’s often meaningless, Agilent Application Note 5990-8341EN, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, 2011.