Extraction, Derivatization and Ultra-Sensitive GC/Triple Quadrupole Analysis of Estrone and Estradiol in Human Serum

Význam tématu

Citlivá detekce a kvantifikace estronu (E1) a estradiolu (E2) v lidské séru je klíčová pro monitorování hormonálních stavů, vyhodnocování účinnosti aromatázy inhibitorů a farmakokinetické studie. Díky extrémně nízkým koncentracím těchto steroidních hormonů v biologických vzorcích vyžaduje analýza vysoce selektivní a citlivé metody.

Cíle a přehled studie

Autoři představují komplexní workflow zahrnující nový krok s použitím silikagelové SPE extrakce, upravený protokol derivatizace pentafluorbenzoilchloridem a optimalizovaná nastavení plynové chromatografie spojené s trojčtverečkovým hmotnostním spektrometrem (GC/TQ MS). Cílem je dosáhnout limitu kvantifikace kolem 1 pg/mL pro E1 a E2 a zajistit robustní a reprodukovatelnou analýzu.

Použitá instrumentace

• SPE: Agilent Bond Elut SI LRC, 500 mg, 10 mL, Vac Elut 24 Manifold
• Vortexer VWR VX-2500, centrifuga Thermo Sorvall ST 16R
• Evaporace: Labconco CentriVap, TurboVap s dusíkem
• Derivatizace: anhydrózní etylacetát, pyridin, pentafluorbenzoilchlorid
• GC/TQ MS: Agilent GC s dvěma DB-17ht kolony (5 m a 15 m), triple quadrupole MSD v NCI režimu s amoniakem

Použitá metodika

Postup zahrnuje:

• Předsrážení: přidání 0,5 M NaOAc, interní standard (d4-E1, d5-E2), extrakce 1-chlorobutanem a centrifugace
• SPE: kondice kartáčků EtOAc, hexany, 1-chlorobutan; naložení vzorku; proplach EtOAc/hexany (1:9) a eluční směsí EtOAc/hexany (1:1)
• Derivatizace: reakce s 1 % PFB-Cl v EtOAc a 10 % pyridinem v EtOAc při 60 °C po 30 min; následné čištění NaHCO3 a hexany
• Rekonstrukce extraktu v dodecanu pro GC/MS analýzu
• GC/TQ MS: program teploty pece 210 °C → 290 °C → 305 °C, doba běhu 10,7 min, MRM režim pro Precursor→Product ion přechody E1/E2 a jejich označených analogů

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda umožňuje detekci estronu a estradiolu s LOQ kolem 1 pg/mL v séru s vynikající opakovatelností a selektivitou. Rozdělení sloučenin na použitém DB-17ht polymeru poskytuje ostré píky s dobrým rozlišením během krátkého běhu. NCI MS/MS režim s amoniakem minimalizuje šum a zvyšuje signál produktu.

Přínosy a praktické využití metody

Postup je vhodný pro klinické výzkumné laboratoře zaměřené na endokrinologii, onkologii a farmakokinetiku steroidních inhibitorů aromatázy. Díky jednoduchému SPE kroku a rychlému GC běhu lze zpracovat větší počet vzorků s vysokou přesností a spolehlivě stanovit nízké koncentrace estrogenu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Plánuje se rozšíření panelu sledovaných steroidů a další automatizace přípravy vzorků pomocí robotických stanic. V budoucnu může být využití vysokopropustné chromatografie nebo kombinace s vysokým rozlišením MS pro širší spektrum metabolitů a endogenních sloučenin.

Závěr

Navržený protokol poskytuje kompletní workflow pro ultrasenzitivní analýzu estronu a estradiolu v lidském séru. Integrace SPE, účinné derivatizace a optimalizovaného GC/TQ MS zajišťuje nízké meze detekce, vysokou reprodukovatelnost a efektivní zpracování vzorků.

Reference

1. M. Churley, A. Macherone, Highly Repeatable Ultra Low Detection of Estradiol Using Triple Quadrupole GC/MS in NCI Mode, Agilent Technologies Application Note 5990-5513EN (2010).
2. A. Macherone, M. Churley, R. White, Ultralow detection of estrogenic compounds by GC–NCI–MS–MS, Curr. Trends Mass Spectrom. (May 2010), pp 10–15.
3. A. Macherone, Derivatization Procedure and Negative Chemical Ionization GC/MS/MS Conditions for the Analysis of Steroidal Analogs, Agilent Technologies Application Note 5990-9478EN (2012).
4. C. Williard, Application of GC/MS/MS in Monitoring Steroids as a Pharmacokinetic and Pharmacological Biomarker, Agilent Technologies (2013).