LC-MS and GC-MS metabolite data processing using Mass Profiler Professional, a chemometric data analysis and visualization tool to determine metabolomic pathways

Význam tématu

Metabolomika ve spojení s proteomikou a genomikou otevírá hlubší vhled do buněčných procesů a jejich reakce na farmaka. Studium dopadu rapamycinu na kultivované lidské buňky HEK pomocí více analytických platforem zajišťuje komplexní pokrytí metabolitů a umožňuje odhalit klíčové biologické dráhy ovlivněné tímto imunosupresivním a protinádorovým činidlem.

Cíle a přehled studie

Cílem této práce je sledovat změny metabolického profilu HEK buněk po ošetření rapamycinem metodami LC-MS v pozitivním a negativním ionizačním módu a GC-MS. Data jsou zpracována chemometrickým nástrojem Mass Profiler Professional (MPP) a integrována s výsledky paralelních genomických a proteomických studií s cílem odhalit společné biologické procesy ovlivněné léčbou.

Použitá metodika a instrumentace

• Extrahce metabolitů z milionu buněk metodou methanol-voda-chloroform v poměru 2 1 2
• LC-MS analýza: Agilent 1290 LC spojený s 6520 QTOF, kolona SB-Aq 2.1×50 mm; gradient metanol 2 98 procent během 13 minut; ESI v pozitivním i negativním módu
• GC-MS analýza: Agilent 7890 GC s 5975C MSD, kolona DB-5MS 30 m×0.25 mm; dvoustupňová derivatizace methoxyaminem a MSTFA
• Normalizace intenzit: epikatechin pro LC-MS, d27-myristická kyselina pro GC-MS
• Software: MassHunter Qualitative, GC Chemstation, AMDIS pro dekonvoluci; Mass Profiler Professional pro zarovnání, statistiku a vizualizaci; databáze METLIN, NIST, Fiehn pro anotaci
• Pět technických replikátů na pět biologických replikátů, data z 16 hodin po podání léčiva

Hlavní výsledky a diskuse

LC-MS v pozitivním módu detekovala více než 700 sloučenin, GC-MS přidala asi 200 dalších. Po eliminaci šumu a zarovnání dat MPP následovala statistická analýza včetně t testu a vyhodnocení změn hladin (fold change). PCA jasně oddělila kontrolu od léčených vzorků. Mezi výrazně regulovanými metabolity byly zvýšené hladiny vitaminu B6, nikotinamidu a oxidované glutationu, pokles glukózy-6-fosfátu a D-ribózy. Spojením obou datových sad vznikl seznam důležitých drah jako glykolýza, purinová metabolizace, transportní procesy ABC transportéry a glycerofosfolipidový metabolismus. Integrace s genomikou a proteomikou potvrdila zjištění o ovlivnění transportu látek a energie ve vztahu k působení rapamycinu.

Přínosy a praktické využití metody

• Víceplatformní přístup zvyšuje pokrytí metabolitů a odhaluje komplexní odpověď buněk
• Mass Profiler Professional umožňuje efektivní zpracování velkého objemu dat a rychlou identifikaci klíčových metabolitů
• Metodika je vhodná pro farmakodynamické studie, hledání biomarkerů a QA QC v biofarmaceutickém průmyslu

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozvoj lze očekávat v zavádění umělé inteligence pro automatizované rozpoznávání vzorců, pokročilé integraci s řízením kvality ve výrobě a klinickými testy, stejně jako aplikaci na single cell metabolomiku a prostorové mapování metabolitů.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace LC-MS a GC-MS společně s pokročilou chemometrickou analýzou pomocí MPP poskytuje ucelený přehled o metabolických změnách po ošetření rapamycinem. Integrace s dalšími omickými daty odhalila biologicky významné dráhy, které mohou sloužit jako cíle pro diagnostiku či terapeutický vývoj.

Reference

1. S Baumann Prest M Jensen M Muehlbauer J Bain Non target GC MS metabolomics using a large volume inlet mid column backflushing and a retention time locked spectral library ASMS poster 2010
2. T R Sana S Fischer G Wohlgemuth A Katrekar K Jung P C Ronald O Fiehn Metabolomic and transcriptomic analysis of the rice response to the bacterial blight pathogen Xanthomonas oryzae pv Oryzae Metabolomics 6 451 465 2010
3. J Boccard J Veuthey S Rudaz Knowledge discovery in metabolomics An overview of MS data handling J Sep Sci 33 290 304 2010
4. T Peng T R Golub and D M Sabatini The Immunosuppressant Rapamycin Mimics a Starvation Like Signal Distinct from Amino Acid and Glucose Deprivation Molecular and Cellular Biology August 5575 5584 2002