Using GCxGC and the Agilent 7200 GC/Q-TOF for an Untargeted Metabolomics Study of the Fungal Rice Pathogen Magnaporthe oryzae

Význam tématu

Rice blast disease způsobená houbou Magnaporthe oryzae patří mezi nejvážnější hrozby pro světovou produkci rýže, s úbytky výnosu až 30 %. Pro efektivní a ekologicky šetrné strategie ochrany je nutné detailní pochopení metabolických mechanismů této patogeneze. Metabolomická analýza poskytuje klíčové informace o výživových a regulačních procesech, které houba využívá při infikování rostlinných pletiv.

Cíle a přehled studie / článku

Studie se zaměřila na bezcílovou metabolomiku (untargeted metabolomics) divokého kmene M. oryzae (WT Guy11) a tří nepatogenních mutantních kmenů s vyřazenými geny pro centrální nitrogenový regulátor (∆nut1), karbonový regulátor (∆mdt1) a integrátor C–N metabolismu (∆tps1). Cílem bylo porovnat metabolické profily, odhalit klíčové metabolity podmiňující patogenitu a naznačit potenciální cíle pro ochranné zásahy.

Použitá metodika a instrumentace

Pro separaci a identifikaci metabolitů byla použita kombinace GC×GC a vysokorozlišovací Q-TOF MS:

• Agilent 7890B GC s termálním modulátorem Zoex ZX2 (modulační perioda 6,8 s)
• Dvourozměrné kolony: primární HP-5MS UI a sekundární SGE BPX-50
• Detekce přes Agilent 7200 GC/Q-TOF ve dvou módech: elektronová ionizace (EI) a pozitivní chemická ionizace (PCI)
• Příprava vzorků: extrakce metabolitů z lyofilizované myceliové tkáně v mixu methanol:chloroform:voda, následná derivatizace methoximací a silylací
• Software: MassHunter pro akvizici a kvalifikaci, GC Image pro vizualizaci, statistickou analýzu a výpočet Fisherova diskriminačního poměru

Hlavní výsledky a diskuse

Porovnání WT a mutantních kmenů odhalilo významné rozdíly v obsahu klíčových C- a N-metabolitů:

• Glycerol, zásadní pro generování turgoru v appresoriu, vyžaduje funkční Tps1 protein
• Variace aminokyselin (např. glutamin, kyselina asparagová, pyroglutamová) a organických kyselin (kyselina jablečná, fumarová, mléčná) korelovala s genotypovými změnami
• U mutantních kmenů ∆nut1 a ∆mdt1 byly zjištěny odlišné profily dusíkatých a uhlíkatých sloučenin, potvrzující roli regulátorů v integraci metabolismu
• PCI analýza potvrdila složitou hyphenaci fragmentačních vzorů, přesnost hmotnostního stanovení (průměrná chyba ~1 ppm) umožnila spolehlivou identifikaci neznámých sloučenin

Přínosy a praktické využití metody

GC×GC/Q-TOF MS přináší zvýšené rozlišení komplexních metabolomů s vysokou reprodukovatelností. Metodika umožňuje odhalit metabolické biomarkery spojené s patogenitou a otevírá cestu k cíleným biochemickým zásahům či vývoji rezistentních odrůd rostlin.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozvoj analytických nástrojů směřuje k vyšší automatizaci a integraci s dalšími „omics“ technologiemi (transkriptomika, proteomika). Potenciál lze vidět v monitorování evoluce patogenů, screening nových fungicidů a studiu interakcí hostitel–patogen v reálném čase.

Závěr

Studie prokázala, že kombinace GC×GC a vysokorozlišovací Q-TOF MS je účinným nástrojem pro pochopení metabolických drah M. oryzae. Identifikace klíčových metabolitů podporuje vývoj nových strategií ochrany rýže a obohacuje poznatky o mechanismu infekce.

Reference

1. Fernandez J., Wilson R. A. Protoplasma 251(1), 37–47 (2014).
2. Wilson R. A., Talbot N. J. Nat. Rev. Microbiol. 7, 185–195 (2009).
3. Fernandez J. et al. PLoS Genet 8: e1002673 (2012).
4. Reichenbach S. In: Comprehensive Two Dimensional Gas Chromatography, L. Ramos (ed.), Elsevier, 2009.
5. Reichenbach S. et al. J. Chromatogr. A 1226, 140–148 (2012).