Characterizing PqsE’s enzymatic activity in Pseudomonas aeruginosa by Volatile Organic Compound analysis with GC×GC-TOFMS

Význam tématu

Pseudomonas aeruginosa představuje závažného oportunního patogena, u něhož je tvorba biofilmů a produkce virulence regulována systémem quorum sensing. Enzym PqsE hraje klíčovou roli v modifikaci signálních molekul a interakci s receptorem RhlR, což ovlivňuje expresi patogenity. Detailní charakterizace enzymatické aktivity PqsE je důležitá pro vývoj nových antimikrobiálních látek cílených proti QS mechanismům.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo identifikovat volitelné organické sloučeniny (VOCs) produkované P. aeruginosa závislé na aktivitě PqsE a kvantifikovat inhibici enzymu malou molekulou Vorinostat. Studie kombinuje kultivaci mutantních i divokého typu k měření zmíněných markerů pomocí vícerozměrné chromatografie s hmotnostní spektrometrií.

Použitá metodika a instrumentace

Pro extrakci a analýzu VOCs byla využita metoda headspace solid-phase microextraction (HS-SPME). Analytické stanovení probíhalo na systému GC×GC-TOFMS (LECO Pegasus BTX 4D) obou­sloupcová chromatografie s modulačním prvkem. Systém autosamplingu L-PAL3 (LECO) zajišťoval automatizovanou přípravu vzorků. Použité chromatografické kolony:

• Primární kolona Rxi-5MS (nonpolární, 20 m×0,18 mm×0,18 µm)
• Sekundární kolona Rxi-17Sil MS (polární, 3,7 m×0,25 mm×0,25 µm)

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza ukázala osm VOCs s významnými rozdíly mezi divokým typem a mutantou D73A. Nejvýraznějším markerem byl acetofenon (F-poměr 695,68), který sloužil ke kvantifikaci in vivo inhibice PqsE inhibitorovou šarží Vorinostat. Naměřené hodnoty ukázaly závislé snižování koncentrace acetofenonu s rostoucí koncentrací inhibitora, přičemž 100 µM Vorinostat vedlo k úrovním srovnatelným s enzymaticky inaktivní mutací. Doplňkové VOCs zahrnovaly benzaldehyd, 2-nonanon, ethylbutanol a další, což naznačuje širší metabolickou změnu spojenou s potlačenou aktivitou PqsE.

Přínosy a praktické využití metody

• Citlivé a specifické sledování enzymatické aktivity PqsE v bakteriální kultuře
• Možnost rychlého screeningu potenciálních inhibitorů QS systému
• Využití acetofenonu jako biomarkeru pro in vivo hodnocení účinnosti antimikrobiálních látek

Budoucí trendy a možnosti využití

• Optimalizace metodiky ke zkrácení doby analýzy a zvýšení propustnosti vzorků
• Zvýšení poměru signál/šum pro detekci stopových VOCs
• Široké screeningové studie nových QS inhibitorů
• Automatizace zpracování dat a integrace do platformy pro rychlé rozhodování v laboratorní praxi

Závěr

Popsaná GC×GC-TOFMS metoda umožnila objev a kvantifikaci VOC markerů souvisejících s aktivitou PqsE v P. aeruginosa. Identifikace acetofenonu jako senzitivního indikátoru a ověření účinnosti Vorinostat podtrhují potenciál této přístrojové platformy pro vývoj nových antimikrobiálních strategií zaměřených na quorum sensing.

Reference

• Carrillo J.-C., Shen H., Momin F., Kral O., Schnieder H., Kühn S. GTL Synthetic Paraffin Oil Shows Low Liver and Tissue Retention Compared to Mineral Oil. Food and Chemical Toxicology 2022, 159, 112701. DOI:10.1016/j.fct.2021.112701.
• IBC Protocol Number: IBC-2022-07-22-15719-irtaylor. MicroMethods Solid-Phase Micro-Extraction (SPME).