Screening to Confirmation: Complete Workflow for Comprehensive Forensic Toxicology Analysis Using a Single Software Platform

Kompletní workflow pro forenzní toxikologii: screening až potvrzení na jedné softwarové platformě

Význam tématu

Forenzní toxikologie vyžaduje spolehlivou a efektivní identifikaci širokého spektra analgetik, stimulantů, benzodiazepinů a dalších látek v biologických matricích. Integrace screeningových (nestandardních, HRMS) přístupů s cílenými konfirmacemi (LC-MS/MS, GC-MS) v rámci jedné platformy snižuje chybovost, zjednodušuje pracovní postupy a zkracuje dobu zpracování výsledků, což je kritické pro soudní a klinické aplikace.

Cíle a přehled studie / článku

Publikace předkládá integrovaný postup využívající softwarové prostředí Shimadzu LabSolutions Insight Explore pro kompletní workflow od rychlého HRMS screeningu (LC-QTOF) přes cílenou kvantifikaci pomocí LC-MS/MS (triple quadrupole) až po potvrzení pomocí GC-MS. Cílem bylo demonstrovat možnost konsolidace zpracování dat, hledání v knihovnách a reportování v jednom prostředí při zachování citlivosti a selektivity potřebné pro forenzní analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika

• Vzorky biologického původu (moč, krev) prošly standardním extrakčním a čistícím postupem a byly doplněny interními standardy.
• Screening proběhl na LC-QTOF v režimu plného skenu a DIA, umožňujícím nontargeted detekci a retrospektivní vyhledávání fragmentačních dat.
• Konfirmační analýzy byly provedeny kombinací LC-MS/MS (MRM) pro kvantifikaci cílových analytů a GC-MS (Scan + SIM) pro potvrzení vybraných látek.
• Vyhodnocení a reportování bylo kompletně zpracováno v software Insight Explore s funkcemi pro library search, reverse search, formulaci sumárních výsledků a označování dat pro review.

Použitá instrumentace

• LC-QTOF (Shimadzu LCMS-9050) — rychlý průtok 0,4 mL/min, kolona Shim-pack Scepter PFPP (1.9 µm, 2.1 × 50 mm), mobilní fáze voda/methanol s amonitovým formiátem a malým množstvím kyseliny; režim DIA umožňoval plný sken MS1/MS2 pro nestandardní screening.
• LC-MS/MS (Shimadzu LCMS-8050RX nebo ekvivalent) — MRM kvantifikace; metoda kvantifikovala 46 analytů se 23 interními standardy během méně než 3 minut s rychlým přepínáním polarity.
• GC-MS (QP2020NX / GCMS-SQ) — kolona Rtx-5ms, programovaná pec (60 °C do 320 °C), helium jako nosný plyn; použit režim Scan (45–500 m/z) a SIM pro cílené sledování více než 50 cílových sloučenin.
• Software — LabSolutions Insight Explore s moduly Analyze a Explore: import více typů knihoven (včetně NIST a dodavatelských knihoven), reverse search, kvantifikace s flaggingem pro review by exception.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografické separace kritických izobarů byly dosaženy — příklady zahrnují oddělení párů morphine/hydromorphone a codeine/hydrocodone a také methamphetamine/phentermine. To potvrzuje vhodnost PFPP kolony a zvolených podmínek pro rychlé rozlišení isobarů.
• LC-QTOF screening detekoval z komplexního směsného standardu více než 10 složek v rámci rychlého běhu (5 minut) a DIA data umožnila následné library vyhledání.
• Příklady identifikací z library: vrchol při 20,01 min byl přiřazen k Methadon s podobností 97 %; jiný vrchol odpovídal Tramadolu s 89% podobností. Software podporoval hledání napříč až 5 knihovnami pro zvýšení důvěry v identifikace.
• Pro kvantifikaci byla použita lineární kalibrace s vážením 1/C2 a akceptační podmínkou, že všechny tři replikáty každého kalibračního bodu musí být v ±20 % přesnosti. LLOQ se v analyzovaných látkách pohybovaly v nízkých ng/mL hodnotách (řádově od ~0,005 do 10 ng/mL), ULOQ typicky 50–100 ng/mL; koeficienty determinace R2 byly většinou ≥0,99, což indikuje dobrou linearitu a opakovatelnost.
• LC-MS/MS metoda dokázala kvantifikovat 46 analytů se 23 ISTD za méně než 3 minuty; GC-MS SIM metoda byla navržena pro cílenou detekci více než 50 látek běžných v toxikologii (barbituráty, benzodiazepiny, aminy, kokain, opiáty apod.).
• Datová konsolidace v jedné platformě zjednodušila porovnání výsledků mezi screeningovými a konfirmačními technikami a umožnila efektivní reportování a export dat.

Přínosy a praktické využití metody

• Konsolidované SW prostředí snižuje potřebu přepínání mezi různými programy a minimalizuje administrativní a lidské chyby při zpracování výsledků.
• Kombinace HRMS screeningu (nestandardní detekce, retrospektivní analýza) s rychlými cílenými metodami (MRM, SIM) poskytuje rovnováhu mezi šíří pokrytí analytů a analytickou citlivostí pro potvrzení.
• Funkce jako reverse search a možnost použití více knihoven zvyšují jistotu identifikace i v komplexních matriích.
• Rychlé analytické časy (řádově minuty) zlepšují průchodnost laboratoře a jsou vhodné pro vysokoprodukční forenzní laboratoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další validace plného workflow pro konkrétní biologické matrice (uvedeno jako budoucí práce, zejména studie návratnosti v moči) je nezbytná před rutinním nasazením.
• Rozšíření a zlepšení spektrálních knihoven a interoperabilita mezi databázemi zvýší spolehlivost identifikací; integrace strojového učení pro prioritizaci kandidátů je pravděpodobný další krok.
• Automatizace přípravy vzorků a zpracování dat může dále zvýšit propustnost a snížit variabilitu výsledků.
• Větší využití retrospektivní analýzy HRMS dat umožní detekci nově vznikajících psychoaktivních látek bez nutnosti nové akvizice dat.

Závěr

Prezentované řešení prokazuje, že je možné realizovat kompletní forenzní toxikologický workflow od screeningu až po potvrzení v rámci jediné softwarové platformy. Kombinace LC-QTOF pro nestandardní screening, LC-MS/MS pro kvantitativní potvrzení a GC-MS pro cílené ověření poskytuje robustní a časově úsporný přístup s vysokou citlivostí a dobrou chromatografickou separací kritických izobarů. Laboratoře však musí provést vlastní validační studie a ověření návratnosti a přesnosti v relevantních matricích před rutinním použitím.

Reference

• Y. Hiramatsu, C. Matos Mejías, S. A. Monti, J. P. Smith, L. Wiest, C. Gilles. Screening to Confirmation: Complete Workflow for Comprehensive Forensic Toxicology Analysis Using a Single Software Platform. Shimadzu Scientific Instruments, Inc. Poster MP725. (Prezentace a experimentální data, autoři a financování spojeno se Shimadzu.)