Evaluation of the programmed temperature vaporiser for large-volume injection of biological samples in gas chromatography

Význam tématu

Přesné stanovení stopových množství biologicky aktivních látek v krevní plasmě je klíčové pro farmakokinetické studie, terapeutické monitorování a forenzní analýzu. Konvenční metody plynové chromatografie s nízkými injekčními objemy často nedosahují požadované citlivosti při detekci v řádu pg–ng/ml. Proto je zásadní vyvíjet postupy umožňující velkoobjemové injekce, které výrazně zvyšují detekční limity.

Cíle a přehled studie

• Ověřit použití programovaného teplotního vaporizeru (PTV) s plněným linerem pro velkoobjemové injekce (50–100 µl) extraktů lidské plazmy do GC.
• Analyzovat vliv čistoty rozpouštědel, zejména ethylacetátu, na pozadí signálu při velkých injekčních objemech.
• Porovnat inertnost a kapacitu různých packingů (ATAS "A", silanizovaná sklovlna, kapiláry TLC) a vybrat nejvhodnější liner.
• Zhodnotit kvantitativní linearitu, meze detekce a vliv detekčních technik (GC-FID vs. GC-MSD v režimu TIC a SIM) na citlivost metody.

Použitá metodika a instrumentace

• SPE: Bond Elut Certify C18 kolony pro separaci kyselých a zásaditých frakcí z 1 ml plazmy; eluční rozpouštědla ethylacetát/acetone a acetonitril/amoniak; re-suspendace ve 100 µl ethylacetátu.
• GC-FID: Hewlett-Packard HP 5890 series II s kapilárou HP-5 (30 m × 0,32 mm × 0,25 µm).
• GC-MSD: HP 5971 MSD s kolonnou HP-5 MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm); režimy TIC (m/z 50–300) a SIM (86, 167, 204, 256).
• PTV injector: OPTIC 2 (ATAS International) s 80 mm × 3,4 mm plněnými linery; packings testovány: ATAS "A", silanizovaná sklovlna, kusy TLC kapilár.
• Teplotní program GC: 40 °C (3 min) → 215 °C (20 °C/min) → 230 °C (5 °C/min) → 290 °C (25 °C/min); detektor 300 °C; helium jako nosné plyn.

Hlavní výsledky a diskuse

• Na kvalitě ethylacetátu závisí pozadí při 100 µl injekci; nejčistší rozpuštědlo minimalizovalo rušivé píky.
• Kapacita linerů: ATAS "A" a silanizovaná sklovlna pojaly >100 µl; ATAS "A" vybral nejlepší kombinaci objemu a inertnosti.
• Inertnost ATAS "A": po 15–20 injekcích plazmových extraktů se barbituráty začaly adsorbovat (barevné zhnědnutí packingů jako indikátor), ostatní třídy látek zůstávaly z převážné části zotaveny.
• Lineární odezva objemu (20–100 µl) i koncentrací (5–2000 ng/ml) pro secobarbital, fenobarbital, lidokain a diazepam (R ≥ 0,999).
• Meze detekce: GC-FID 5–10 ng/injekce; GC-MSD (TIC) 4–5 ng; GC-MSD (SIM) až 0,25 ng → ekvivalent ~0,25 ng/ml v plasmě při 100 µl injekci.
• Matrix background: silné při GC-FID, redukované v GC-MSD TIC, téměř eliminované v GC-MSD SIM.

Přínosy a praktické využití metody

• Výrazné zlepšení citlivosti pro farmacokinetiku, toxikologii a klinickou analýzu.
• Integrovaná separace kyselých a zásaditých složek s vysokou selektivitou MSD-SIM.
• Minimalizace pracné předúpravy vzorků a možnost automatizace díky robustnosti PTV injektoru.

Budoucí trendy a možnosti využití

• On-line spojení SPE–GC pomocí PTV pro plně automatizované bioanalytické stanovení.
• Další optimalizace packingu a povrchové deaktivační techniky pro prodlouženou inertnost.
• Rozšíření aplikace na jiné biologické matricé (moč, tkáně) a širší spektum léčiv.
• Implementace vysokorozlišovací MSD a pokročilé režimy selektivního monitoringu iontů.

Závěr

Aplikace PTV s ATAS "A" linerem umožňuje spolehlivé velkoobjemové injekce biologických extraktů, vede k několikanásobnému zlepšení detekčních limitů a zefektivnění workflow v biomedicínských a forenzních laboratořích.

Použitá instrumentace

• PTV injector OPTIC 2 (ATAS International).
• GC-FID: HP 5890 series II s HP-5 (30 m × 0,32 mm × 0,25 µm).
• GC-MSD: HP 5971 s HP-5 MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm).
• SPE: Bond Elut Certify C18, Visiprep (Supelco).