Metabolite Identification in Blood Plasma Using GC/MS and the Agilent Fiehn GC/MS Metabolomics RTL Library

Význam tématu

Komplexní identifikace a kvantifikace malých molekul v biologických vzorcích je nezbytná pro výzkum metabolických drah a diagnostiku onemocnění. GC/MS poskytuje vysoké oddělovací schopnosti a citlivost, což umožňuje detekovat široké spektrum metabolitů. Nové knihovny se zaměřením na retenční časy zvyšují spolehlivost a standardizaci výsledků.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo demonstrovat využití GC/MS s Agilent Fiehn GC/MS Metabolomics RTL Library pro identifikaci metabolitů v lidské krevní plazmě. Studie se zaměřuje na optimalizaci retenčního časového zámku (RTL), hromadnou dekonvoluci spekter a propojení výsledků s biologickými daty.

Použitá metodika a instrumentace

Popis přípravy vzorku:

• Sběr krevní plazmy od dobrovolníků, odstředění a zmrazení při –80 °C.
• Extrahované 30 μl plazmy v roztoku isopropanol:acetonitril:voda (3:3:2) při 20 °C.
• Dvojstupňová derivatizace: methoximace (MEOX) při 30 °C/90 min a trimethylsilylace (MSTFA+1%TMCS) při 37 °C/30 min.

Instrumentace:

• GC: Agilent 6890 s kolónou DB-5MS (29 m, 0,25 mm, 0,25 μm) s předkolónou Duragard 10 m.
• Teplotní program: 60 °C (1 min) → 325 °C při 10 °C/min (10 min); celkem 37,5 min.
• MSD: Agilent 5973; elektronový ionizační režim EI, režim skenování 50–600 m/z, přenosová linka 290 °C.
• RTL: interní standard d27-myristová kyselina, průměrné odchylky <0,15 min.
• Software: Agilent ChemStation, AMDIS pro dekonvoluci, Agilent Fiehn GC/MS Metabolomics RTL Library (vyd. 2008).

Hlavní výsledky a diskuse

• Identifikováno 102 metabolitů v plazmě, včetně aminokyselin, sacharidů, mastných kyselin, aromatických sloučenin a sterolů.
• Průměrná odchylka retenčních časů <0,15 min zajišťuje vysokou jistotu anotací.
• Signal-to-noise ratio >100 vedlo k čistým shodám spekter s net match >80.
• Přibližné příklady: cholesterol a glukóza identifikovány s vysokými faktory shody; itakonová a citrakonová kyselina odlišeny navzdory podobným spektrogramům.
• Rozdíl mezi split a splitless vstřikem ovlivňuje krátké retenční časy (<9 min), kde může docházet k posunům až 0,4 min.
• Klasifikace podle chemických tříd ukázala rovnoměrné zastoupení hlavních metabolických skupin.

Přínosy a praktické využití metody

• RTL zvyšuje reprodukovatelnost a standardizaci GC/MS analýz metabolitů.
• AMDIS dekonvoluce umožňuje rychlou identifikaci ve složitých chromatogramech.
• Propojení s externími databázemi (PubChem, KEGG) usnadňuje biologickou interpretaci méně známých sloučenin.
• Metoda je vhodná pro farmakogenomiku, klinické studie, QA/QC a průmyslovou analytiku.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření knihoven o nové deriváty a isomery pro zlepšení specifity.
• Integrace s dalšími separačními metodami (LC/MS, CE/MS) pro multiplatformní přístup.
• Automatizace a standardizace protokolů v souladu s doporučeními Metabolomics Society a NIH/NIDDK.
• Využití strojového učení pro pokročilé dekonvoluční algoritmy a predikci retenčních časů.

Závěr

Metoda GC/MS s retenčním časovým zámkem a knihovnou Agilent Fiehn RTL poskytuje spolehlivou, vysoko-propustnou identifikaci metabolitů v komplexním vzorku krevní plazmy. Retenční zámek zajišťuje konzistentní časy, AMDIS zlepšuje dekonvoluční výkon a propojení s databázemi rozšiřuje biologickou interpretaci.

Reference

1. Sumner LW, Amberg A, Barrett D, Beger R, Beale MH, Daykin C, Fan TWM, Fiehn O, Goodacre R, Griffin JL, Hankemeier T, Hardy N, Higashi R, Kopka J, Lindon JC, Lane AN, Marriott P, Nicholls AW, Reilly MD, Viant M (2007) Proposed minimum reporting standards for chemical analysis. Metabolomics 3, 211–221.
2. Castle LA, Fiehn O, Kaddurah-Daouk R, Lindon JC (2006) Metabolomics standards workshop and the development of international standards for reporting metabolomics experimental results. Brief. Bioinform. 7, 159–165.
3. Halket JM, Przyborowska A, Stein SE, Mallard WG, Down S, Chalmers RA (1999) Deconvolution gas chromatography mass spectrometry of urinary organic acids – rapid identification of metabolic disorders. Rapid Commun Mass Spectrom. 13, 279–284.
4. Agilent Technologies (2008) Agilent Fiehn GC/MS Metabolomics RTL Library Product Note. Pub. 5989-8310EN.
5. Agilent Technologies (2008) G1676AA Agilent Fiehn GC/MS Metabolomics RTL Library User Guide. P/N G1676-90000.