MIDI Sherlock Microbial Identification System Operating Manual

Význam tématu

U microbiologické identifikace hraje klíčovou roli spolehlivá analýza profilů mastných kyselin, protože složení buněčných lipidů úzce koreluje s taxonomií. Automatizovaný Sherlock Microbial Identification System (MIS) využívá metody přípravy vzorků a plynovou chromatografii (GC) k získání kvalitativně i kvantitativně reprodukovatelných profilů MK, které jsou porovnávány s rozsáhlými referenčními databázemi („knihovnami“). Díky tomu lze bez předchozí biochemické předselekce přesně určit neznámé mikroorganismy z čistých izolátů.

Cíle a přehled studie / článku

Tento manuál představuje komplexní popis instalace, obsluhy a údržby Sherlock MIS verze 6.2 s GC Agilent 6890/6850/7890 a softwarem Agilent ChemStation. Cílem je ukázat postupy přípravy extraktů metodami saponifikace, esterifikace a extrakce MK, automatizované pořizování dat, vyhodnocení chromatogramů a porovnání s metodami a knihovnami (TSBA6, CLIN6, MOORE6, YST28 atd.). Dokument definuje postupy pro různé skupiny mikroorganismů (aeroby, anaeroby, kvasinky, mykobakterie, aktinomycety, houby).

Použitá metodika a instrumentace

Sherlock MIS kombinuje:

• GC Agilent 6890/6850/7890 s automatickým injektorem a zásobníkem (100-pozicový nebo 27/8-pozicový turret)
• Kapilární kolona 5% fenyl-methyl siloxan (25 m × 0,2 mm)
• FID detektor pro detekci MK esterů
• Sherlock software verze 6.2 na Windows XP/2000 s Agilent ChemStation (A.10.01/B.01.01)
• Datové knihovny (TSBA6, RTSBA6, CLIN6, MOORE6, YST28, FUNGI6, ACTIN6 atd.)
• Reagencie pro saponifikaci (NaOH/MeOH), methylaci (HCl/MeOH + H₂SO₄/MeOH), extrakci (hexan/MTBE) a konečné odmytí (NaOH/NaCl)

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza MK esterů umožňuje identifikovat většinu mikroorganismů se shodou Similarity Index > 0,95. Postup nabízí:

• Automatickou kalibraci s RMS chybou < 0,003 ECL
• Detekci degradace hydroxy MK přes kvantitační kontrolu (Q-check)
• Rychlé režimy Rapid/Sensitive/Instant FAME s kratším časem analýzy a vyšší citlivostí
• Vestavěné kontroly kvality: pozitivní/negativní kontrolní organismy, kontrola reagencií, maintenance alerty

Přínosy a praktické využití metody

• Bezpečná identifikace mikrobů v klinické, potravinářské, environmentální a průmyslové mikrobiologii
• Zkrácení doby analýzy bez nutnosti chromatografické expertízy
• Vysoce reprodukovatelné výsledky díky samokorekčním mechanismům
• Možnost vlastních knihoven (Library Generation Software) a compliance 21 CFR 11 s ERS modulem

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s genomickými a proteomickými omik metodami
• Cloudová sdílení knihoven a vzdálené vyhodnocování dat
• Zrychlení extrakce a chromatografie (mikroextrakční techniky, ultra-rychlé kolony)
• Rozšíření databází o nové taxonomické skupiny a anaerobní kultury

Závěr

Sherlock MIS poskytuje robustní a flexibilní řešení pro identifikaci mikroorganismů na základě MK profilů. Díky standardizované přípravě vzorků, automatizované kontrole kvality a široké paletě metod a knihoven umožňuje rychlé, přesné a reprodukovatelné určení širokého spektra bakterií, kvasinek i hub. Pravidelná údržba (výměna septa, liners, kolony) a kontrola parametrů zaručují dlouhodobou spolehlivost systému.

Reference

• MIDI Inc. Sherlock Microbial Identification System Operating Manual, Version 6.2, September 2012
• Agilent Technologies ChemStation Software Guides, verze A.10.01 / B.01.01
• Voltolini, G. et al. Rapid GC-FID Analysis of Fatty Acid Methyl Esters. Journal of Microbiological Methods, 2011
• Zhi, S. et al. Profiling of Microbial Fatty Acids in Clinical Diagnostics. Analytical Chemistry Insights, 2014