Bacterial Identification by Gas Chromatographic Analysis of Fatty Acid Methyl Esters (GC-FAME)

Význam tématu

Analýza profilu mastných kyselin pomocí plynové chromatografie methylesterů (GC-FAME) poskytuje přesný, objektivní a vysoce reprodukovatelný nástroj pro identifikaci širokého spektra bakterií. Díky charakteristickým vzorcům nasycených, rozvětvených a hydroxylovaných kyselin se tato metoda osvědčila v klinické mikrobiologii, environmentálních studiích i potravinářské a průmyslové analýze.

Cíle a přehled studie

Cílem technické poznámky bylo představit systém Sherlock MIS pro automatizovanou identifikaci bakterií na základě GC-FAME, demonstrovat postup kultivace, vzorkování a přípravy vzorku, popsat nastavení chromatografu a databáze knihoven a ukázat praktickou výkonnost systému.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek bakteriální biomasy je získán z kultivace na vhodném agaru standardizované fyziologické stáří. Příprava vzorku zahrnuje:

• Saponifikaci (NaOH/MeOH),
• Methylaci (HCl/MeOH),
• Extrahování methylesterů (hexan/MTBE),
• Čištění organické fáze (NaOH).

Chromatografická analýza probíhá na Agilent GC (modely 5890, 6850, 6890) s kapilární kolonkou Ultra 2 (25 m × 0,2 mm, fenyl-metyl). Program teplot: 170 °C až 270 °C (5 °C/min), následný čistící krok na 300 °C. Plynový chromatograf je vybaven plamenoionizační detektorem, autosamplerem a počítačovým systémem Sherlock MIS pro automatické pojmenování píků a porovnání s rozsáhlou databází.

Hlavní výsledky a diskuse

Sherlock MIS dokáže rozlišit více než 1 500 bakteriálních druhů a analyzovat až 200 vzorků za den. Použití ekvivalentní délky řetězce (ECL) umožňuje přesné rozlišení izomerů do šířky 0,010 ECL jednotky. Automatické vnitřní kalibrování minimalizuje drift mezi běhy a zaručuje stabilní výkon až po dva dny nepřetržitého provozu.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda GC-FAME nabízí:

• Vysokou objektivitu a reprodukovatelnost bez nutnosti subjektivní mikroskopie či biochemických testů,
• Rychlou identifikaci s minimální přípravou a nízkými náklady (cca 2,50 USD na vzorek),
• Možnost rozsáhlé databázové podpory včetně geograficky různorodých kmenů,
• Široké uplatnění v mikrobiologii, QA/QC, ekotoxikologii, potravinářství i lékařském výzkumu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšiřování knihoven o nové druhy i poddruhy, integrace s genomickými daty a zlepšení rychlosti analýzy díky novým vysoce publikačním částicím. Dále se otevírá prostor pro automatizované on-line systémy a propojení s platformami strojového učení pro rychlejší a přesnější predikci taxonomického zařazení.

Závěr

Plynová chromatografie mastných kyselin v kombinaci se systémem Sherlock MIS představuje robustní a efektivní přístup k bakteriální identifikaci. Standardizovaný workflow a rozsáhlé referenční knihovny umožňují rychlou a spolehlivou práci ve špičkových laboratořích.

Reference

• Forsblom B., Sarkiala K.E., Jousimies-Somer H. (2000). Agar pitting gram-negative rods in the subgingival flora of dogs. Anaerobe 6, 163–168.
• Vandamme P., Vancanneyt M., Segers P., Ryll M., Kohler B., Ludwig W., Hinz K.H. (1999). Coenonia anatina gen. nov., sp. nov., a novel bacterium associated with respiratory disease in ducks and geese. Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 867–874.
• Kozdrój J., van Elsas J.D. (2000). Response of the bacterial community to root exudates in soil polluted with heavy metals assessed by molecular and cultural approaches. Soil Biol. Biochem. 32, 1405–1417.
• Kaufman M.G., Walker E.D., Smith T.W., Merritt R.W., Klug M.J. (1999). Effects of larval mosquitoes (Aedes triseriatus) and stemflow on microbial community dynamics in container habitats. Appl. Environ. Microbiol. 65, 2661–2673.
• Lee H.K., Chun J., Moon E.Y., Ko S.H., Lee D.S., Lee H.S., Bae K.S. (2001). Hahella chejuensis gen. nov., sp. nov., an extracellular-polysaccharide-producing marine bacterium. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 661–666.
• Graves M., Robin T., Chipman A.M., Wong J., Khashe S., Janda M. (1997). Four additional cases of Burkholderia gladioli infection with microbiological correlates and review. Clin. Infect. Dis. 25, 838–842.
• Hopkins M.J., Sharp R., Macfarlane G.T. (2001). Age and disease related changes in intestinal bacterial populations assessed by cell culture, 16S rRNA abundance, and community cellular fatty acid profiles. Gut 48, 198–205.
• Hsueh P.R., Jene T.L., Ju P.H., Chi C.Y., Chuan S.C., Wu H.S. (1998). Outbreak of Pseudomonas fluorescens bacteremia among oncology patients. J. Clin. Microbiol. 36, 2914–2917.
• Osterhout G.J., Shull V.H., Dick J.D. (1991). Identification of clinical isolates of gram-negative nonfermentative bacteria by an automated cellular fatty acid identification system. J. Clin. Microbiol. 29, 1822–1830.
• Norman D.J., Yuen J.M.F. (1998). A distinct pathotype of Ralstonia (Pseudomonas) solanacearum race I, biovar I entering Florida in pothos (Epipremnum aureum) cuttings. Can. J. Plant Pathol. 20, 171–175.
• Walcott R.R., Langston D.B. Jr., Sanders F.H. Jr., Gitaitis R.D. (2000). Investigating intraspecific variation of Acidovorax avenae subsp. citrulli using DNA fingerprinting and whole cell fatty acid analysis. Phytopathology 90, 191–196.
• Pirttijärvi T.S.M., Ahonen L.M., Maunuksela L.M., Salkinoja-Salonen M.S. (1998). Bacillus cereus in a whey process. Int. J. Food Microbiol. 44, 31–41.
• Song B., Palleroni N., Haggblom M.M. (2000). Isolation and characterization of diverse halobenzoate-degrading denitrifying bacteria from soils and sediments. Appl. Environ. Microbiol. 66, 3446–3453.
• Coenye T., Laevens S., Gillis M., Vandamme P. (2001). Genotypic and chemotaxonomic evidence for the reclassification of Pseudomonas woodsii (Smith 1911) Stevens 1925 as Burkholderia andropogonis (Smith 1911) Gillis et al. 1995. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 51, 183–185.
• Huys G., Altwegg M., Hanninen M.L., Vancanneyt M., Vauterin L., Coopman R., Torck U., Luthy H.J., Janssen P., Kersters K. (1996). Genotypic and chemotaxonomic description of two subgroups in the species Aeromonas eucrenophila and their affiliation to A. encheleia and Aeromonas DNA hybridization group 11. Syst. Appl. Microbiol. 19, 616–623.
• Rainey F.A., Burghardt J., Kroppenstedt R.M., Klatte S., Stackebrandt E. (1995). Polyphasic evidence for the transfer of Rhodococcus roseus to Rhodococcus rhodochorus. Int. J. Syst. Bacteriol. 45, 101–103.
• Norton C.D., LeChevallier M.W. (2000). A pilot study of bacteriological population changes through potable water treatment and distribution. Appl. Environ. Microbiol. 66, 268–276.
• MIDI, Inc. (2001). Sherlock Microbial Identification System References.