Fully Automated Online Trimethylsilyl (TMS) Derivatization Protocol for Metabolite Profiling Using an Orbitrap GC-MS and High Resolution Accurate Mass Metabolomics Library

Význam tématu

Metabolomika na bázi plynové chromatografie s hmotnostní spektrometrií (GC-MS) je klíčová pro komplexní profilování nízkomolekulárních metabolitů. Trimethylsilylová (TMS) derivatizace je standardní postup ke zvýšení volatility a stability polárních látek. Ruční derivatizace bývá však časově náročná, náchylná k chybám a vede k vyšší variabilitě výsledků. Automatizovaný online protokol zvyšuje reproducibilitu, zkracuje dobu přípravy a umožňuje nepřetržitý provoz v režimu vysokého průtoku vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo zavést a validovat plně automatizovaný online dvoustupňový TMS derivatizační protokol pro metabolomické profilování na platformě Thermo Scientific. Studie hodnotila:

• Funkčnost dvoustupňové derivatizace methoxyaminem (MOX) a MSTFA/TMCS v automatizovaném režimu.
• Stabilitu a reprodukovatelnost po dobu 24 hodin nepřetržitého provozu.
• Komparaci s klasickou ruční derivatizací z hlediska variability (RSD).
• Možnost spolehlivé identifikace metabolitů pomocí vysokorozlišovací GC-Orbitrap knihovny a softwaru TraceFinder.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky obsahující standardní směs 14 aminokyselin byly sušeny pod dusíkem a derivatizovány online pomocí autosampleru TriPlus RSH, který umožňuje dva inkubační kroky a překryvné zpracování až 26 vzorků v 24h cyklu. Dvoustupňová derivatizace:

• MOX v pyridinu (90 min, 30 °C, 600 rpm).
• MSTFA/1 % TMCS (30 min, 37 °C, 600 rpm).

Analytická instrumentace:

• GC: TRACE 1310, injekční objem 1 μL, liner single taper, split 5:1 (EI) se splitless prvních 2 min, He 1,0 mL/min.
• Oven program: 60 °C (1 min) → 10 °C/min do 325 °C (9,5 min).
• MS: Q Exactive GC Orbitrap, EI/PCI, full-scan, 60 000 FWHM při m/z 200, m/z 60–800 (EI), 100–1000 (CI), elektr. energie 70 eV.
• Software: TraceFinder 4.1 pro dekonvoluci, kvantifikaci a identifikaci vůči HRAM GC-Orbitrap metabolomics library.

Hlavní výsledky a diskuse

Automatizovaný online protokol prokázal:

• Výbornou repetabilitu s průměrným RSD 5,85 % (všechny aminokyseliny <10 % RSD).
• Stabilní hmotnostní přesnost <1 ppm pro kvantitní ionty během 24 h.
• Vyšší spolehlivost identifikace díky nízké chybě hmotnosti a výkonnému vyhledávání v TraceFinder knihovně (hledací index >918).
• Ve srovnání s ruční derivatizací výrazně nižší průměrné RSD (5,13 % vs. 14 %).

Přínosy a praktické využití metody

Automatizace derivatizace přináší:

• Výrazné snížení manuální práce a rizika chyb.
• Zvýšení průtoku vzorků díky překryvnému zpracování a simultánnímu provozu dvou inkubátorů.
• Okamžitou injekci po derivatizaci, čímž se minimalizuje rozpad nestabilních TMS derivátů.
• Vyšší kvalitu dat s konzistentními RSD a hmotnostní přesností, vhodné pro QA/QC i výzkum.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Integrace s dalšími hyphenovanými technikami (LC-MS, GC×GC-MS) pro širší metabolitový záběr.
• Miniaturizace a další automatizace přípravy vzorků v mikrotitrach pro snížení spotřeby reagencií.
• Pokročilá datová analýza využívající umělou inteligenci a strojové učení pro rychlejší identifikaci a kvantifikaci.
• Rozšíření HRAM knihoven o nové deriváty a lipidomické profily.

Závěr

Plně automatizovaný online TMS derivatizační protokol umožňuje vysokou repro­ducibilitu, nízkou variabilitu a robustní identifikaci metabolitů pomocí GC-Orbitrap MS. Toto řešení významně zkracuje čas laboratorní práce a přináší spolehlivé výsledky vhodné pro náročné aplikace v oblasti metabolomiky.

Reference

1. Fiehn O. Metabolomics by Gas Chromatography-Mass Spectrometry: Combined Targeted and Untargeted Profiling. Curr. Protoc. Mol. Biol. 2016, 114, 30.4.1-30.4.32.
2. Bruce SJ, et al. A plasma global metabolic profiling approach applied to an exercise study monitoring the effects of glucose, galactose and fructose drinks during post-exercise recovery. J. Chromatogr. B. 2010, 878, 3015-3023.
3. Koek MM, et al. Quantitative metabolomics based on gas chromatography mass spectrometry: Status and perspectives. Metabolomics. 2011, 7, 307-328.