Identification of metabolites in human plasma using GC-Orbitrap-MS after online derivatization

Význam tématu

Plynulá chromatografie plynů (GC) kombinovaná s vysokorozlišovacím Orbitrap hmotnostním spektrometrem (GC-Orbitrap-MS) nabízí v oblasti metabolomiky klíčové výhody. Díky vysoké chromatografické i hmotnostní rozlišovací schopnosti a přístupu k rozsáhlým spektrometrickým knihovnám lze spolehlivě identifikovat široké spektrum polárních až polovodných metabolitů. Automatizované on-line derivatizační postupy navíc minimalizují variabilitu způsobenou nestabilitou derivátů a zvyšují reprodukovatelnost analýz.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat schopnost GC-Orbitrap-MS pro kvalitativní screening metabolitů v lidské plazmě za použití on-line derivatizace. Autoři si kladli za úkol optimalizovat rychlý derivatizační protokol bez přídavného off-line čekání, zajistit vysokou přesnost hmotnostních měření a prověřit opakovatelnost detekce vybraných sloučenin.

Použitá instrumentace

• GC systém TRACE 1310 s kapilární kolónou TraceGOLD TG-5SilMS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm)
• Orbitrapová hmotnostní spektrometrie Q Exactive GC Orbitrap MS (EI, 70 eV, rozlišení 60 000 FWHM při m/z 200)
• On-line derivatizátor Gerstel MultiPurpose Sampler (MPS) s Gerstel Maestro softwarem
• Analytický software TraceFinder pro dekonvoluci, shodu spekter (SI) a filtraci vysokého rozlišení (HRF)

Použitá metodika

Vzorek lidské plazmy (20 µL) byl extrahován 300 µL methanolu, centrifugován a vysušen dusíkem. První derivatizační krok s methoxyaminem-HCl v pyridinu (80 °C, 15 min) proběhl off-line a poté bylo sucho doplněno vazebným činidlem MSTFA v MPS. Druhý krok silylace (80 °C, 15 min) proběhl on-line těsně před injekcí (split 5:1, 250 °C). Spektra byla snímána v režimu full-scan m/z 50–650 při sub-ppm přesnosti.

Hlavní výsledky a diskuse

Bylo detekováno zhruba 200 dekonvolvovaných stop s vysokou intenzitou. Identifikace proběhla porovnáním SI (>900) a HRF (>99 %) proti knihovně obsahující více než 850 metabolitů. Příklad: pyroglutamová kyselina 2TMS byla identifikována s kombinovaným skóre 97,8 %. Opakovatelnost vybraných sloučenin (např. ribóza 4TMS, myo-inositol 6TMS, cholesterol TMS) vykázala RSD 5–12 %, což odpovídá požadavkům metabolomických studií (<15 %). On-line derivatizace odstranila proměnnou dobu setrvání derivátů na autosampleru, a tím omezila variabilitu signálů.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje rychlý screening a spolehlivou identifikaci polárních i nepolárních metabolitů v komplexních biologických matricích. Automatizace derivatizace a vysoká hmotnostní přesnost zkracují čas analýzy, minimalizují chyby obsluhy a zvyšují homogenitu dat. Pro klinickou metabolomiku, toxikologii a farmakokinetiku takový přístup přináší vyšší průtok vzorků a lepší reprodukovatelnost.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj směruje k rozšíření knihoven s dalšími derivatizačními třídami a implementaci více kroků on-line přípravy v jednom běhu. Další vylepšení by mohla přinést softwarová umělá inteligence pro automatickou anotaci nových sloučenin a real-time kvantifikaci. Kombinace GC-Orbitrap-MS s datově bohatými přístupy snímání by mohla posunout metabolomiku nejen směrem ke schopnosti analyzovat ultra-trace sloučeniny, ale i k integraci výsledků s jinými spektroskopickými technikami.

Závěr

Studie prokázala, že on-line derivatizace ve spojení s vysokorozlišovacím Orbitrap spektrometrem poskytuje spolehlivou a reprodukovatelnou platformu pro identifikaci metabolitů v lidské plazmě. Klíčovými prvky jsou přesnost hmotnostních měření, rozsáhlá knihovna spekter a automatizované časově řízené přípravy vzorků.

Reference

1. Zarate E. a kol. Fully automated trimethylsilyl derivatisation protocol for metabolite profiling by GC-MS. Metabolites 2017, 7, 1.
2. Villas-Boas S. a kol. Mass Spectrometry in metabolome analysis. Mass Spectrom. Rev. 2005, 24, 613–646.
3. Koek M.M. a kol. Quantitative metabolomics based on gas chromatography mass spectrometry: Status and perspectives. Metabolomics 2011, 7, 307–328.
4. Thermo Fisher Scientific. Orbitrap GC-MS HRAM Metabolomics Library (2017).
5. Thermo Fisher Scientific. Application Notes AN10457, AN10488.