Laboratórne postupy stanovenia PCB látok - čast 2

Podrobnejšie tu rozoberiem metódy stanovenia pomocou plynovej chromatografie s detektorom elektrónového záchytu (GC-ECD).

Predtým by som sa chcel v krátkosti vrátiť k už spomínanej toxicite PCB látok, o ktorých sa dosť často hovorí v médiách, aby si aj nový čitateľ tohoto článku mohol urobiť fundovanejší pohľad na túto problematiku.

Pre zopakovanie: výrobky s obsahom PCB látok (napr. Delor v ČSSR, Aroclor v USA a GB, Fenoclor v Francúzsku, Clophen v Nemecku, Sovol v ZSSR, atď.) boli používané najmä ako teplovodné médiá a tvorili aj súčasť náterových hmôt. Ich výroba bola v 70. rokoch vo svete postupne zastavená, v ČSSR až v r. 1984.

PCB látky v životnom prostredí dosiaľ pretrvávajú, ale ich perzistencia postupne klesá. Ľudia sú vo všeobecnosti vystavení ich účinkom prostredníctvom dýchacích ciest (kontaminovaného vzduchu zo zle uzavretých skládok), potravinového reťazca (vody, vypestovanej zeleniny z kontaminovanej pôdy, kontaminovaných živočíchov – hlavne s vyšším obsahom tuku) a priamym kontaktom s pokožkou (práce pri likvidácii odpadov). Po exponovaní sa niektoré PCB látky môžu zmeniť na iné chemické látky interakciou s inými organickými látkami priamo vo vnútri tela, ktoré môžu byť ešte toxickejšie. PCB látky sa vylučujú z tela výkalmi, močom alebo môžu zostať v tele človeka roky, pričom sa čas vylúčenia z organizmu na ich nízko toxickú hranicu odhaduje na 10 – 15 rokov. V organizme sú prednostne ukladané do tukových tkanív, prechádzajú placentou a vylučujú sa aj do materského mlieka. Pri expozícii vysokými dávkami pri nehodách pri práci s PCB látkami bol pozorovaný rad príznakov ako napr. chlorakné a iné kožné prejavy, poškodenie oka, neurologické príznaky, dysfunkcia pečene, zvýšenie cholesterolu a triacylglyceridov v krvi, alterácie v metabolizme sacharidov a imunitná supresia. Podľa IARC (Medzinárodná agentúra pre výskum rakoviny) sú PCB zaradené do skupiny 2A – karcinogénov podozrivých pre človeka. Do karcinogénneho procesu zasahujú nepriamo indukciou enzýmov, ktoré aktivujú karcinogény. Významné je aj ich imunotoxické pôsobenie, podiel na zvýšení cholesterolémie a indukcia kyslíkových radikálov.

”Výrobky s obsahom PCB látok boli používané najmä ako teplovodné médiá a tvorili súčasť náterových hmôt. Ich výroba bola v 70. rokoch vo svete postupne zastavená, v ČSSR až v r. 1984. PCB látky v životnom prostredí dosiaľ pretrvávajú, ale ich perzistencia postupne klesá. Ľudia sú vo všeobecnosti VYSTAVENÍ ICH ÚČINKOM prostredníctvom dýchacích ciest (kontaminovaného vzduchu zo zle uzavretých skládok), potravinového reťazca (vody, vypestovanej zeleniny z kontaminovanej pôdy,... ) a priamym kontaktom s pokožkou (práce pri likvidácia odpadov)...”

K najtoxickejším kongenérom patria bifenyly so štyrmi, piatimi a šiestimi atómami chlóru. Ide predovšetkým o kongenéry, ktoré majú dva atómy chlóru substituované v polohe para (4- a 4‘-) a aspoň dva atómy chlóru v polohe meta, pričom nesmie byť žiadny atóm chlóru v polohe orto. Týmto podmienkam vyhovujú tieto štyri kongenéry: 77, 81 (3,3‘,4,4‘-tetrachlorbifenyl a 3,4,4‘5-tetrachlorbifenyl), 126 (3,3‘,4,4‘,5-pentachlorbifenyl), 169 (3,3‘,4,4‘,5,5‘-hexachlorbifenyl). Označujú sa ako neorto-kongenéry alebo tiež koplanárne kongenéry a spolu s monoorto kongenérmi (105, 114, 118, 123, 156, 157, 167, 189) tvoria skupinu PCB nazývanú dioxínom podobné PCB (DL- PCB). Akútne otravy spôsobené týmito látkami sú skôr výnimočné.

Výsledný graf získaných výsledkov stanovenia PCB (suma kongenérov PCB−28, 52, 101, 105, 118, 138, 153, 156 a 180) v materskom mlieku

Pri analytickom stanovení PCB sa obsah polychlorovaných bifenylov stanovuje v súčasnosti takmer výlučne vysoko rozlišovacou plynovou chromatografiou (HRGC – High Resolution Gas Chromatography) s detekciou elektrónového záchytu (ECD – Electron Capture Detector) alebo hmotnostnou detekciou (MS – Mass Spectrometry). Obidve tieto techniky majú vysokú citlivosť detektoru, veľmi účinnú separáciu a dobrú reprodukovateľnosť. Plynová chromatografia využíva na delenie zmesi látok vo vzorke rozdeľovanie jednotlivých zložiek na separačnej kolóne, s použitím plynnej mobilnej fázy s použitím vhodného nosného plynu.

Chromatogram z GC-ECD materského mlieka obohateného 9.25 mg.l⁻¹ PCB

Chromatogram pri validácii metódy GC-ECD na stanovenie polychlórovaných bifenylov v rybách – pražma zlatistá v mori v Grécku

Vzorka sa po nástreku do plynového chromatografu musí previesť do plynnej fázy, ktorá je nosným plynom vnášaná do separačnej kolóny. Jednotlivé zložky vzorky sú potom separované na základe rozdielnych interakcii so stacionárnou fázou a sú postupne uvoľňované (eluované) inertným nosným plynom. Nosný plyn slúži iba na transport zložiek kolónou, sám neinteraguje so separovanými zložkami a stacionárnou fázou. Zložky, ktoré postupne vychádzajú z kolóny sú postupne indikované vhodným detektorom. Účinnosť separácie v plynovej chromatografii závisí predovšetkým od nasledujúcich parametrov:

• nosný plyn: bežne sa používajú hélium (hlavne pre MS detekcia), argón, dusík, preferovaný je vodík napr. pre ECD (detektor elektrónového záchytu) a FID (detektor plameňo-ionizačný),

• separačná kolóna: rozmery kolón nie sú dnes limitujúcim faktorom, ale platí všeobecná zásada, že čím dlhšia kolóna tým lepšia separácia, ale nesmú sa prekročiť limitujúce tlaky v kolóne. V minulosti však pri krátkych náplňových kolónach 3 až 6 m, bol problém s dobrou separáciou zložiek. Pri veľmi dlhej kolóne (kapilárnej), respektíve v spojení dvoch kolón, je potrebný vysoký tlak nosného plynu, čo je obmedzujúce. U bežných komerčných 30 až 50 m kapilárnych kolón predpisuje výrobca pracovné tlaky. Dnes pri používaní nových softvérov (napr. GC Agilent), zadá obsluha iba typ kolóny a pracovný tlak sa nastavuje automaticky, ten sa iba následne kontroluje, ak by vznikla nejaká anomália. Bežná dĺžka kolón pre analýzu majoritných kongenérov PCB je od 30 m a vnútorný priemer do 0,25 mm. Je známe, že kapiláry s priemerom menším ako 0,15 mm zlepšujú separáciu PCB, ale vznikajú problémy s tlakovým spádom.

• stacionárna fáza: Tenšia vrstva zakotvenej fázy na kolóne (pod 30 μm) je na nepolárnych kolónach vhodná pre zníženie celkovej doby analýzy. Vo všeobecnosti sa však najviac používajú stredne polárne fázy. Pre zaujímavosť, chromatografické dáta všetkých 209 kongenérov PCB boli publikované už v roku 1984 pre kolónu SE-54 (50 m x 0,2 mm, i. d., fáza 5%-difenyl-1%-vinyldimethylsiloxan), táto kolóna je dnes adekvátna kolóne DB-5, HP-5. Ide o stredne polárnu fázu. Vtedy sa už podarilo separovať 187 kongenérov, ostatných 11 párov vykazovalo rovnaký retenční čas.

Metóda plynovej chromatografie s detektorom elektrónového záchytu (GC-ECD)

Detektory zachytávania elektrónov sú až 1 000-krát citlivejšie ako detektory plameňovej ionizácie (FID) a boli prvými detektormi schopnými merať komponenty na úrovni častí na miliardu (ppb) a častí na bilión (ppt) koncentrácie. Práve táto vysoká citlivosť robí tento detektor vhodný pre environmentálne merania. Detektor elektrónového záchytu je bežne používaný pre kvantifikáciu PCB látok ale tiež pri testovaní prostredia na detekciu organochlórových pesticídov, herbicídov a rôznych halogénovaných uhľovodíkov. Tento detektor sa vyznačuje vysokou citlivosťou, absolútny limit detekcie je asi 100 fg (fentogramov). Pracuje na princípe proporcionálneho čítača pre meranie intenzity rádioaktívneho žiarenia. Ako zdroj žiarenia sa najčastejšie používa beta žiarič izotop 63Ni, ktorý uvoľňuje elektróny. Žiarenie beta na rozdiel od nebezpečného žiarenia gama schopného prenikať hlboko do ľudského tela má len bezvýznamnú prenikavosť nepresahujúcu 50 μm. Žiarič je v detektore odtienený tak, aby žiarenie z detektora neprenikalo do prostredia. Pre zaujímavosť, podľa článku získaného z Internetu, tento typ žiariča použil tím mladých ruských výskumníkov na vyvinutie prototypu beta-voltaickej batérie, ktorá sa nedobíja, nepotrebuje údržbu a vydrží sto rokov. Využíva tzv. betavoltaický efekt, transformujúci žiarenie beta z rozpadu rádioaktívnych izotopov na elektrický prúd.

ECD detektor

Citlivosť ECD rastie s počtom chlórových atómov v molekule PCB, má však iba obmedzenú oblasť lineárnej odozvy. Preto nie je vhodné používať jednobodové kalibrácie. Ako nosný plyn sa pre GC/ECD používa vodík, pomocný plyn („make-up“) dusík či zmes argón/metán. Elektróny emitované rádioaktívnou fóliou sa pohybujú príliš rýchlo na to, aby ich zachytili molekuly analytu, musia byť spomalené. To sa dá dosiahnuť zavedením ďalšieho inertného plynu do bunky ECD, ktorý koliduje s rýchlymi elektrónmi a tým ich spomaľuje. Metán redukuje elektrónovú energiu zrážkou bez ionizácie metánu a vyhýba sa interferenčným účinkom ako je ionizácia zložiek.

Princíp fungovania detektora elektrónového záchytu a obrázok klasického ECD detektora staršieho typu

V súčasnosti je klasický „robustný“ ECD nahradený detektorom s mikrocelou μ-ECD, ktorý má 10x menší objem cely. Micro ECD umožňuje použitie nástreku do chromatografu v systéme splitless (priameho nástreku vzorky bez delenia, obyčajne v μl ) alebo split (možnosť zníženia koncentrácie nástreku, napr. 1:100), ako aj teplotne programovanej analýzy na optimalizáciu separácie vzorky. Veľmi stabilná základná hodnota a podmienky nízkeho šumu výrazne znižujú jeho detekčné limity. Micro ECD je možné prevádzkovať buď s režimom jednosmerného prúdu, pulznej frekvencie alebo s konštantným prúdom.

Podrobné analytické postupy pre stanovenie PCB kongenérov v pevných, kvapalných a plynných vzorkách sú zahrnuté v ISO (medzinárodná organizácia pre normalizáciu) normách. Mnohé tieto postupy, „metódy testovania“, boli prebraté od EPA (United States Environmental Protection Agency, agentúry pre ochranu životného prostredia USA). Napríklad podrobný postup stanovenia PCB kongenérov v pitnej, podzemnej a odpadovej vode metódou GC-ECD je zahrnutý v medzinárodnej norme ISO 6468, ktorá bola implementovaná aj do všetkých európskych noriem ako napr. STN EN ISO 6468, ČSN EN ISO 6468, atď. Norma popisuje odber vzorky, jej úpravu, technické vybavenie pre analýzu, postup analýzy, kalibráciu a vyhodnotenie merania. Tieto normy sú spoplatnené a nie sú tak lacné. Oproti tomu metodiky EPA sú voľne prístupné napr. na Internete. Sú však iba v anglickom ja zyku, ale dnes to nie je problém. Napríklad norma EPA 8082A popisuje postup stanovenia PCB látok ako Aroclors metódou GC-ECD podľa jednotlivých kongenérov v extraktoch z tuhej fázy, v tkanivách a vodnej fázy.

Praktické cvičenia pracovníkov KCHL CO pri detekcii vysokotoxických látok v KCHL CO v Nitre

Pri analýze vzoriek životného prostredia na prítomnosť PCB látok sa v plynovej chromatografii zvyčajne používa pri úprave vzorky technika extrakcie ako sú: kvapalina – kvapalina, kvapalina – tuhá fáza, plyn – kvapalina a plyn – tuhá fáza. Ide spravidla o zakoncentrovanie záujmového súboru, v našom prípade PCB látok do extrakčného činidla. Tieto extrakčné techniky som podrobnejšie popísal v článku v revue CO 6/2018 zverejnených pod názvom Aplikácia moderných analytických metód pri identifikácii neznámych látok. Spomínané extrakčné techniky zamerané na analýzu metódou plynovej chromatografie sa postupne vyvíjali a zdokonaľovali. Dnes výrobcovia predávajú celý rad tohto sortimentu ako napr.: SPE, SPME, HeadSpace, Twister a pod. Treba ešte pripomenúť, že pri analýzach s určovaním jednotlivých kongenérov PCB je nutné mať potrebnú zmes štandardov s čistotou pre chromatografiu. Tieto štandardy nie sú tiež lacnou záležitosťou a majú spravidla obmedzenú životnosť – závisí, v akom sú rozpúšťadle (izooktán, acetón, n.hexán a pod.). Sú potrebné pre kvalitatívne ale tak aj kvantitatívne stanovenie PCB metódou GC-ECD.

Praktické cvičenia pracovníkov KCHL CO pri detekcii vysokotoxických látok v KCHL CO v Nitre

Veľmi zaujímavou analýzou pri použití tejto metódy bolo stanovenie PCB látok v materskom mlieku na Slovensku, ktorú vykonal Ústav preventívnej a klinickej medicíny v Bratislave v rámci realizácie projektu. Článok bol publikovaný v roku 2 000. PCB sa stanovovali vo vzorkách materských mliek od prvorodičiek (dobrovoľných darkýň), zo šiestich modelových oblastí Slovenska. Mlieko sa vzorkovalo podľa smerníc WHO v období 2 až 10 týždňov po pôrode. Materské mlieko obsahuje okolo 4,2 % tuku. Koncentrácie PCB dosahovali v priemere (862 ± 417) ng.g⁻¹ mliečneho tuku. Najvyššie hodnoty (aritmetický priemer = 1 318 ng.g⁻¹, n = 12) sa našli v lokalite bývalého výrobcu PCB, Chemko Strážske.

Prehľad nálezov PCB v jednotlivých druhoch rýb v oblasti Zemplínskej Šíravy v okrese Michalovce v rokoch 2000 až 2005

Pri tejto analýze tuku rýb bolo analyzovaných 18 kongenérov PCB, ktorých koncentrácia v jednotlivých vzorkách sa pohybovala podľa zdroja publikácie od 5,04 do 335,5 ng/g.

Pre porovnanie, obsah PCB látok v rybách zo Zemplínskej šíravy sa pohyboval v rozmedzí 13,67 – 108,75 mg.kg⁻¹, pričom v ostatných regiónoch Slovenskej republiky mali oveľa nižšiu hodnotu od 0,01 – 14,25 mg.kg⁻¹. Prepočet jednotiek: 1mg/kg = 1000 ng/g.

Pokračovanie v budúcom čísle