Identifikace bakterií plynovou chromatografií Agilent 7890B

Identifikace bakterií v rutinních laboratořích je založena na několika přístupech. Nejrychlejší jsou metody přímé mikroskopické, které však jenom zřídka umožní přesnou identifikaci. Časově náročnější, i když průkaznější, jsou metody kultivační, spojené s biochemickou nebo sérologickou identifikací. Od přelomu tisíciletí se uplatňují také metodiky molekulární biologie, založené na rychlých PCR technikách, nebo chemotaxonomické, identifikující bakterie na základě celobuněčných proteinů nebo spektra mastných kyselin (MK). Oba poslední přístupy (molekulární i chemotaxonomické) jsou časově nenáročné, finančně dostupné a poskytují spolehlivou identifikaci běžně se vyskytujících bakteriálních druhů.

Identifikace bakterií s pomocí plynové chromatografie Agilent 7890B je založená na analýze spektra MK s využitím identifikačního systému MIDI Sherlock® MIS (1). Doposud bylo popsáno více než 300 různých typů MK vyskytujících se v bakteriálních buňkách v různých kombinacích, rozdílných druh od druhu (1,2). Identifikační systém Sherlock obsahuje několik databází obsahující profily MK více než 1500 bakteriálních druhů a také cca 200 druhů kvasinek (1). Samotná identifikace je pak založena na porovnání spektra MK neznámého vzorku s profily MK (známých druhů) v určité databázi a následným vyhodnocením míry podobnosti spekter MK mezi vzorkem a profily v databázi.

Pro zajištění správné identifikace je nezbytné standardizovat celý postup přípravy vzorků pro plynovou chromatografii a přísně dodržovat stanovené podmínky. Samotná analýza plynovou chromatografií je pak plně automatizovaná a nevyžaduje žádné optimalizace nebo zásahy zvenčí.

Klíčovým krokem v přípravě vzorků je samotná kultivace. Profil MK se v průběhu životního cyklu bakterií mění a nejvyšší stabilitu vykazuje v logaritmické (exponenciální) fázi růstu (1). Je tedy nezbytné připravovat extrakty pro plynovou chromatografii z biomasy aktivně a rychle rostoucích buněk. Profil MK je dále také závislý na kultivačních podmínkách, zejména teplotě a složení média (3,4). Pro zajištění správné identifikace je tedy nutné dodržovat všechny stanovené podmínky kultivace a to čas, teplotu a složení média. Tyto podmínky jsou charakterizovány pro každou databázi systému Sherlock, se kterou je porovnáván neznámý vzorek, environmentální nebo klinický.

Samotná příprava vzorku vychází z cca 20 mg připravené biomasy, která se nejdříve saponifikuje, což uvolní řetězce MK z molekul membránových fosfolipidů. Následně jsou MK metylovány za vzniku metylesterů a extrahovány do organické fáze tvořené hexanem. Připravený extrakt se pročišťuje alkalickým roztokem, což snižuje možnost kontaminace lineru, chromatografické kolony nebo detektoru zbytky buněk a reagencií (2).

Analýza plynovou chromatografií Agilent 7890B vyžaduje převedení vzorků do plynné fáze a smíchání s nosným plynem, k čemuž slouží liner. Při přechodu kolonou jsou přitom jednotlivé MK ve vzorku rozlišeny mobilitou v koloně, která se liší v závislosti na počtu atomů uhlíku, dvojných vazeb a stechiometrii. Sherlock systém vyžaduje jako nosný plyn vodík a výsledná detekce je založena na ionizaci MK ve vodíko-vzduchovém plamenu detektoru (FID).

Výsledkem identifikace je zpráva obsahující popisy jednotlivých vzorků včetně data analýzy, tabulky detekovaných MK a jejich identifikace, procentuálního zastoupení, retenčních časů a eventuálních komentářů k odchylkám (Obrázek 1). Součástí identifikačního výstupu je dále chromatogram – tedy záznam z chromatografu znázorňující jednotlivé analyty (jednotlivé typy MK) ve formě píků spolu s retenčními časy.

Samotná identifikace je uvedena v identifikačním výstupu jako tzv. shoda (Match). Tato shoda udává identifikaci do druhu spolu s tzv. indexem podobnosti (Similarity Index - SI). Pro identifikaci bakterií je nutné sledovat nejen druhovou identifikaci, ale také index podobnosti, který by se měl pro spolehlivou druhovou identifikaci pohybovat nad hodnotou 0.500 (Obrázek 1). Systém Sherlock někdy poskytuje i identifikaci tzv. druhé a další volby – obvykle příbuzné druhy (nebo rody) k prvnímu navrhovanému taxonu (Obrázek 2). V takovém případě je nutno sledovat rozdíl hodnot SI mezi jednotlivými taxony.

HPST - Obrázek 1 - Identifikační výstup systému Sherlock na základě plynové chromatografie metylesterů MK. Tabulka obsahuje jednotlivé MK s retenčními časy (RT) a procentuálním zastoupení ve vzorku. Chromatografický záznam znázorňuje průběh analýzy daného vzorku, jednotlivé detekované MK, jejich RT a také množství (plocha píků). RT - retenční čas; Response – množství MK; Ar/Ht – poměr plochy a výšky píků; RFact – faktor odezvy; ECL – ekvivalentní délka řetězce; Peak Name – identifikovaná MK; Percent - % zastoupení dané MK ve vzorku; Comment1,2 – komentáře software

HPST: Obrázek 2 - Identifikační výstup systému Sherlock poskytující více možných identifikací. Vzhledem k vysokému SI Citrobacter freundii a rozdílu první a druhé nabízené identifikace (0,164) je možné považovat identifikaci kmene jako C.freundii za spolehlivou.

Pokud je SI první volby hodnota nad 0,500 a zároveň rozdíl mezi touto hodnotou a další volbou 0,100 a více, jedná se o spolehlivou druhovou identifikaci (5). Pokud se hodnota SI prvního taxonu pohybuje v rozmezí 0,300 – 0,500 ale rozdíl od druhé nabídnuté identifikace je větší než 0,100, jedná se o dobrou identifikaci a pravděpodobně atypický kmen. Hodnoty pod 0,300 jsou pro uzavření identifikace nedostačující a obvykle znamenají, že daný druh není v databázi, systém Sherlock přesto nabídne nejbližší příbuzné druhy. Nespornou výhodou, kterou tento systém nabízí, je nejen rutinní identifikace bakteriálních izolátů, ale také možnost tvoření vlastních databází nebo shlukovaní izolátů do dendrogramů (Obrázek 3), histogramů, či 2D diagramů (Obrázek 4) na základě specifických parametrů. Nadstavbové součásti systému umožňují také sledovaní a vyhledávaní shodných kmenů mezi izoláty, což může být využitelné zejména z epidemiologického hlediska.

HPST: Obrázek 3 - Dendrogram podobnosti izolátů sestavený systémem Sherlock na základě profilu MK po analýze plynovou chromatografií.

HPST: Obrázek 4 - Diagram rozložení MK C(16:0) a Summed Feature 8 (C18:1 Ω7c a/nebo C18:1 Ω6c) u 6 různých bakteriálních izolátů z Antarktidy

Závěrem lze říct, že mikrobiologické využití plynové chromatografie Agilent 7890B v kombinaci s identifikačním systémem Sherlock je velice různorodé. Na jedné straně je možná rychlá a spolehlivá identifikace neznámých bakteriálních izolátů, což má význam především pro rutinní laboratoře. Na straně druhé je možné využít tuto analýzu ve výzkumu nebo epidemiologii vzhledem k možnostem, které nabízí samotný identifikační program.