Validační program pro statistické zpracování analytických dat

Validační program slouží ke statistickému prokázání spolehli­vosti analytické metody včetně celého obslužného analytického systému (proces určení vhodnosti měření a získávání dat v celém analytickém systému), kdy proces získávání a zpracování experimentálních dat má významný vliv na konečný analytický výsledek. Tento program stanovuje základní pravidla pro plánování a organizaci validace analytických dat a stanovuje pravidla pro uvádění a užití takto stanovených ukazatelů v praxi. Validaci můžeme definovat jako procedura, jejímž cílem je demonstrovat a dokumentovat kvalitu analytické metody ustanovením definovaných kriterií a měřením hodnot těchto kriterií. Validace je zjednodušeně řečeno ověření platnosti zvoleného analytického postupu (metody). Vlastnost, která je předmětem validace se nazývá validovaná vlastnost (koncentrace hlavní látky, koncentrace nečistoty, fyzikálně chemický parametr). Validace se používá vždy při validaci nové metody, při převodu (transferu) validované metody (např. z vývojové do přijímací laboratoře, publikované validované metody), při kontrole způsobilosti systému a při revalidaci metody, kdy podmínky revalidace jsou striktně stanoveny.

Definice a problematika konfirmace a validace je prodrobně rozebrána v předchozím článku.

Validační program musí obsahovat nejméně tyto údaje:

• pracovní postup
• validační parametry
• podmínky revalidace systému
• validační protokol
• literatura (kritická rešerše a konzultace)

Zkrácená verze: Detailní informace včetně konkrétních výpočtů jednotlivých parametrů naleznete na webu HPLC.cz - Validační program pro statistické zpracování analytických dat

1. Druhy validací

Validace metody v rámci jedné laboratoře se nazývá interní (vnitřní) validace a podle účelu může tato být validace průzkumová, plná atd.

Interní validace, jejímž cílem je na omezeném počtu vzorků stanovit, zda zvolená analytická metoda je vhodnou metodou pro plnou validaci, se nazývá průzkumová validace. Zaměřuje se na vyhodnocení delikátních validačních parametrů jako je selektivita a robustnost, a na stanovení opakovatelnosti na omezeném počtu vzorků.

Po prokázání vhodnosti průzkumové validace následuje plná validace, jejímž cílem je demonstrovat vhodnost metody k zamýšlenému použití vyhodnocením všech požadovaných validačních parametrů.

Při zavedení publikované validované analytické metody (resp. validované metody v jiné laboratoři) se používá tzv. validace při převodu metody a obvykle zahrnuje stanovení správnosti a přesnosti. K ověření platnosti dříve plně zvalidované metody se používá kontrola způsobilosti metody a zahrnuje pouze kontrolu kalibrační přímky (linearita a citlivost).

Existují-li již dříve naměřená data, která byla naměřena za stejných podmínek, může se použít tzv. retrospektivní validace, která umožní vyhodnotit jeden z nejdůležitějších validačních parametrů - opakovatelnosti.

Externí (vnější) validace zahrnuje interní validaci společně s validací metody srovnáním výsledků metody z více laboratoří (mezilaboratorní porovnávací zkoušky) a zahrnuje výpočet reprodukovatelnosti metody.

2. Pracovní postup

Pracovní postup (po výběru dané analytické metody) je chápán jako úplný analytický předpis, který slouží k reprodukování celé analytické metody. Proto musí obsaho­vat všechny nezbytné instrukce, musí být dostatečně přesný, podrobný a úplný. Pracovní postup musí být dostatečně optimalizován a takto používán se statistickou kontrolou měření.

Pracovní postup musí obsahovat následující údaje:

a) stručná charakteristika postupu - oblasti použití metody, princip postupu, chemické re­akce a interakce stanovované složky, analyt a matrice, rozmezí ob­sahů stanovované složky, princip měření a jednotky

b) roztoky, činidla a pomocné chemikálie - chemická čistota použi­tých chemikálií, jejich úprava a čištění, příprava rozpouštědel, činidel a pomocných chemikálií, stabilita a koncentrace

c) standardní operační procedura - mechanická úprava vzorku, chemická úprava vzorku, kalibrace, měření, výpočty a hodnocení.

V případě zavedených chyb nebo uvádění nepřesných a neúplných informací v pracovním postupu, dochází k používání subjektivních postupů operátora, což způsobuje zvyšování variability získaných experimentálních dat.

3. Validační parametry

3.1 Přesnost metody

Přesnost metody (1) je definována jako údaj o míře těsnosti shody mezi vzájemně nezávislými (2) výsledky zkoušek za předem specifikovaných podmínek. Přesnost závisí pouze na rozdělení náhodných chyb a nemá vztah k pravé hodnotě.

Míra přesnosti se vyjadřuje (počítá) jako směrodatná odchylka výsledků zkoušek.

Přesnost za podmínek opakovatelnosti se vyjadřuje jako opakovatelnost.

Není-li směrodatná odchylka závislá na obsahu (X), uvádí se její absolutní hodnota v těch jednotkách jako samotný výsledek, je-li směrodatná odchylka závislá na obsahu, uvádí se relativní hodnota v % nebo jako desetinný zlomek. Je-li směrodatná odchylka konstantní v ce­lém oboru měřených hodnot, pak se také počítá relativní směrodatná odchylka vztažená na nejvyšší hodnotu souboru xmax.

3.1.1 Směrodatná odchylka sx

Protože je směrodatná odchylka náhodná veličina, nemůže být pokládána za obecně platnou charakteristiku dané analytické metody a musí být specifikována:

a) pro přesně specifikovaný pracovní postup bez sebemenších odchylek, v hodnotě sx musí být zahrnuty všechny zdroje variability, tedy i ty, které plynou z pracovního postupu (rozklad vzorku, rozpouštění, extrakce, ředění, konečné instrumentální měření), v případě jakékoli změny v pracovním postupu se musí hodnota směrodatné odchylky revalidovat

b) musí být určena z dostatečně velkého počtu vzorků téhož materiálu, směrodatná odchylka platí pro danou koncentrační hladinu a materiál

c) nesmíse určovat z jedné ověřovací série, ale z dlouhodobého měření.

3.1.2 Opakovatelnost

V případě dvou paralelních stanovení se přesnost výsledků určuje pomocí tzv. dovolené diference paralelních stanovení, tj. maximální rozpětí, které charakterizuje přesnost výsledků a dovoluje toto rozpětí vysvětlit přítomností náhodných chyb.

Opakovatelnost metody je definována jako těsnost shody mezi navzájem nezávislými výsledky zkoušek získanými za podmínek opakovatelnosti (podmínky, kdy navzájem nezávislé výsledky zkoušek se získají opakovaným použitím téže zkušební metody na identickém materiálu, v téže laboratoři, týmž pracovníkem za použití týchž přístrojů a zařízení, během krátkého časového rozmezí (viz definice shodnosti).

3.1.3 Podmínky stanovení směrodatné odchylky a opakovatelnosti

Pro určení směrodatné odchylky se zvolí nejméně pěti úrovňových hladinách (X) tak, aby počet vzorků m byl nejméně 20, při počtu paralelních stanovení nA=2. Do validačního protokolu se uvádí všechny změřené veličiny a vypočtená směrodatná odchylka.

Jestliže se předpokládá funkční závislost mezi Rmax a úrovňovou hladinou (X), vyšetří se, zda Rmax závisí na X a určí se tato závislost (hodnota Rmax (resp. sx má snahu nabývat větších hodnot s rostoucí koncentrační úrovni (X)). V případě, že se nehomogenita materiá­lu stává nedílnou součástí rozptýlení výsledků, bude možno očekávat funkční závislost pouze v případě, že i tato heterogenita je funkcí X.

Pro zjednodušení se uvažují pouze dva druhy závislosti - lineární, který je vyjádřený rovnicí Rmax = a + bX nebo exponenciální závislost, vyjádřená rovnicí log Rmax = c + d.log X.

Pro koeficienty a = 0 a d = 1 jsou rovnice ekvivalentní a dává se přednost rovnici lineární.

V případě b = 0 (pro většinu výsledků je b £ 0,1) je Rmax (resp. sx) konstantní v celém rozsahu hodnot X. (5) Není-li směrodatná od­hylka závislá na obsahu, počítá se relativní směrodatná odchylka vzhledem k největší hodnotě souboru xmax. Dovolená diference se vypočítá z naměřených dat podle rovnice 3 pro zvolenou hladinu významnosti, která je uvedena.

3.2 Správnost metody

Přesnost metody je definována jako těsnost shody získané hodnoty s jeho hodnotou skutečnou přijatou referenční hodnotou. Jedná se tedy o statisticky významnou rozdílnost mezi získanou a skutečnou hodnotou. Hodnocením správnosti metody je tedy určit přítomnost či nepřítomnost náhodné soustavné složky chyby otestováním velikosti rozdílu nebo soustav­nosti znaménka mezi hodnotou "dáno" a "nalezeno", a to buď porovnáním se standardem, porovnáním analýz ověřované a osvědčené (zavedené) metody, srovnáním s referenčním materiálem, výsledky z referenční laboratoře.

3.2.1 Výtěžnost metody - recovery

Při určení recovery a následného testu platí následující akceptační kriteria:

a) počet paralelních opakování k určení směrodatné odchylky sx pro danou koncentrační hladinu musí být minimálně sedm a relativní směrodatná odchylka sx musí být 3 % pro každou koncentrační hladinu. Průměrná výtěžnost Re se musí pohybovat mezi 95 % a 105 % pro každou koncentrační hladinu.

b) srovnávací vzorky musí pokrývat celý koncentrační obsah analytu a koncentrační hladina odpovídá většinou 50 % až 200 % nominální koncentrace analytu ve vzorku; obvykle se volí minimálně tři koncentrační hladiny.

V případě, že srovnávací vzorek není dostupný, pak se použije referenční hodnota certifikovaného referenčního materiálu nebo se použije referenční hodnota získaná jinou nezávislou metodou resp. metodami nebo se použije positivních vzorků s přídavkem analytu (standardní přídavek). Vnesení přídavku by se mělo provést v takovém kroku analytického postupu, aby byl posti­žen celý pracovní postup. Odezva analytu se stanovuje nejméně v sedmi positivních vzorcích ze kterých se počítá průměr analytu. Vzorky se standardním přídavkem se opakují nejméně sedmkrát na nejméně třech koncentračních hladinách. Při výpočtech se opět postupuje podle rovnice 4 a 5 a platí stejná akceptační kriteria uvedená výše.

3.2.2 Test regresní rovnicí

Pomocí tohoto testu se zjišťuje, zda je výše (čl.3.2.1) prokázaná soustavná chyba konstantní, nebo proporcionální, tj. závislá na obsahu analytu.

3.2.3 Porovnání s referenčním materiálem

Podmínkou pro použití tohoto srovnání k určení přesnosti metody je dostupnost referenčního materiálu s deklarovanou koncentrací (xref) a deklarovanou shodností danou směrodatnou odchylkou (sref).

3.3 Volba kalibračního modelu

3.3.1 Linearita

Linearita je chápána jako přímková závislost mezi dvěma náhodnými proměnnými, tj. odezvou instrumentace (analytickým signálem) a koncentrací analytu. Těsnost vzájemné závislosti dvou náhodných proměnných charakterizuje korelační koeficient (r). Při lineární závislosti nabývá hodnoty +1 a čím více se blíží jedné, tím je závislost obou proměnných těsnější.

Pro lineární kalibraci se řeší dva problémy:

a) volba vhodného kalibračního modelu a výpočet odhadu jeho parametrů

b) odhad směrodatné odchylky

3.3.2 Citlivost metody. Vliv matrice vzorku

Citlivost metody je definována jako rozdíl v koncentraci analytu, který odpovídá nejmenšímu rozdílu, jenž může být ještě detekován při odezvě instrumentace metody. Matematicky je citlivost metody vyjádřena jako první derivace kalibrační funkce y = f(x).

Vliv matrice vzorku na hodnotu směrnice a úseku regresní křivky se prokazuje srovnávacím roztokem kalibračních roztoků s matricí za stejných akceptačních podmínek (3.1) a vypočtou se hodnoty koeficientů a´, b´ a provede se statistické testování (19a,b). Jestliže jsou koeficienty a, b v rámci chyby shodné, pak přítomnost odchylky kalibrace vlivem matrice nebyla prokázána. V případě, že se prokáže vliv matrice, je třeba používat ke kalibraci kalibračních roztoků v příslušné matrici.

V případě, že matrice vzorku není dostupná, použije se metoda standardního přídavku pro pět koncentračních hladin (v minimálně dvou opakování) k positivnímu vzorku pro stanovení shodnosti směrnic regresních křivek (porovnání úseku-koeficientu a´ u této metody není možné). Vypočte se směrnice kalibrační křivky b´ a provede se statistické testování (19a). Jestliže jsou směrnice v rámci chyby shodné, pak přítomnost odchylky kalibrace vlivem matrice nebyla prokázána. V případě, že se prokáže vliv matrice, je třeba používat místo vyhodnocení kalibrační křivkou používat metodu standardního přídavku k potlačení vlivu matrice na odchylku kalibrace.

3.3.3 Mez detekce metody

Mez detekce odpovídá koncentraci, pro kterou je analytický signál statisticky významně odlišný od šumu.

Mez detekce udává skutečnou úroveň signálu, která ještě umožňu­je detekci koncentrace.

U separačních metod se používá k výpočtu meze detekce velikost hodnoty signálu slepého pokusu. Podmínkou je, že jsou k dispozici chromatogram slepého pokusu a směrnice kalibrační přímky.

3.3.4 Mez stanovitelnosti

Mez stanovitelnosti je nejmenší hodnota signálu, pro kterou je relativní směrodatná odchylka predikce z kalibračního modelu dostatečně malá a obyčejně se pokládá hodnotě 0,1.

U separačních metod se používá k výpočtu meze stanovitelnosti velikost hodnoty signálu slepého pokusu. Podmínkou je, že jsou k dispozici chromatogram slepého pokusu a směrnice kalibrační přímky.

3.4 Selektivita

Selektivita analytické metody je definována jako schopnost přesného a správného určení analytu i v přítomnosti interferujících látek (matrice). Selektivní metoda je tedy taková metoda, která za určitých podmínek umožňuje přesné a správné stanovení obsahu složky ve vymezené směsi jiných složek.

Selektivita analytické metody je testována porovnáním výsledků vzorků standardů s výsledky vzorků s matricí. Interference matrice se projevuje tím, že analytický signál neodpovídá stanovovanému analytu, ale tento signál je superponován signálem rušivé složky (čistota signálu). Prokazování selektivity metody je do jisté míry závislé na použité instrumen­tální technice a proto je nutné pro každý použitý systém vypracovat individuální program prokazování selektivity metody.

V případě, že je dostupná matrice vzorku, k zjištění selektivity metody se analyzují srovnávací vzorky matrice, srovnávací vzorky metody (vzorek bez přítomnosti matrice a analytu - rozpouštědla) v minimálním počtu tří těchto vzorků a kalibrační standard o nejnižší koncentraci. Stanoví se velikost a rozptyl signálů pozadí a významnost těchto signálů vzhledem k výsledku kalibračního standardu (statistické testování F-testem shody rozptylů a t-testem shody středních hodnot).

V případě prokazatelné statistické významnosti velikosti pozadí signálu:

• pocházejícího ze srovnávacího vzorku metody, se musí odstranit zdroj interference (kontaminace rozpouštědla, laboratorního nádobí, přístrojů)
• pocházejícího ze srovnávacího vzorku matrice, je nutné optimalizovat extrakci vzorku, předseparaci (čištění vzorku), chromatografickou separaci.

Odezva interferujících látek musí být menší než 1 % odezvy nejnižší koncentrační hladiny analytu ve vzorku.

V případě, že matrice vzorku není dostupná provedou se stejné operace jako v předešlém případě mimo analýz srovnávacích vzorků matrice; místo analýz srovnávacích vzorků matrice se použijí positivní vzorky s analytem a sledují se kvalitativní data signálu, zda je signál tvořen pouze sledovaným analytem (UV spektra, IR spektra pro standardní substanci a vzorek).

V případě, že detekční metoda neumožní sbírat kvalitativní data, použije se k prokázání čistoty signálu jiná technika nebo se používají certifikované materiály s přijatou referenční hodnotou a selektivita metody se takto prokazuje nepřímo.

3.5 Robustnost metody

Robustnost metody je definována jako míra vlivu kolísání úrovně jednotlivých parametrů na výsledek analytického stanovení. Další definice a postupy ověření robustnosti jdou uvedeny v části Robustnost metody.

3.5.1 Postup

Statistická optimalizace má význam hlavně v instrumentální analýze, musí být však pečlivě naplánována i provedena (ideální případ je on-line propojení s PC). Dále si ukážeme postup ověření robustnosti dle Placketta a Burmana.

Při každé optimalizaci musí být předem definována účelová funkce y (např. směrodatná odchylka), která nabývá za optimálních podmínek určitého extrému a lze ji kvantitativně vyčíslit.

Dále musí být určeny faktory x, které významně ovlivňují hodnotu y. Jako faktory mohou být použity jenom vzájemně nezávislé proměnné.

Statistická optimalizace se zpravidla provádí v několika po sobě jdoucích krocích:

a) zvolí se účelová veličina (účelová funkce), která nabývá za optimálních podmínek svého maxima nebo minima. Tato veličina je vy­jádřena kvantitativně (číselně), označuje se y.

b) uváží se jednotlivé faktory, které mohou mít vliv na konečný výsledek, popř. na hodnotu účelové funkce y, a to i takové, jejichž vliv lze jenom předpokládat. Jednotlivé faktory se označí x.

c) z velkého počtu faktorů se určí ty, které výrazně ovlivňují účelovou funkci.

d) pro významně se uplatňující faktory xi se určí extrém (minimum nebo maximum) účelové veličiny y. Ty hodnoty xi, za nichž y nabývá optima (minima nebo maxima) představují optimální podmínky analytické metody.

3.6 Statistické testování

Statistické testování se uplatňuje při objektivním porovnávání výsledků analýz na dvou souborech experimentálně získaných dat (např. určení významnosti způsobu přípravy vzorků, vliv teploty, času, koncentrace použitých při konkrétním pracovním postupu).

3.6.1 Test shody rozptylů

3.6.2 Test shody středních hodnot

3.6.3 Odlehlé hodnoty

Pro použití v analytické praxi k vyloučení odlehlých výsledků (6) je nejvhodnější Grubbsův test T za použití míry rozptýlení, která je podobná směrodatné odchylce (populační směrodatná odchylka), nebo Deanův a Dixonův test Q za použití rozpětí R nebo Studentovým t-testem.

3.6.3.1 Grubbsův test

Při tomto testu se výsledky seřadí podle velikosti...

3.6.3.2 Deanův a Dixonův test

Při tomto testu se výsledky seřadí podle velikosti...

3.6.3.3 Studentův t-test

Výhodou tohoto testování oproti Grubbsovu testu a testu podle Deana a Dixona je, že při testování odlehlých výsledků neovlivní výpočet hodnoty t velikost směrodatné odchylky sx nezahrnuje testované krajní hodnoty souboru dat.

3.6.3.4 Cochranův test

Cochranův test se používá v pokusech s jednoduchými úrovněmi, neboť se jedná o test homogenity rozptylů. Cochranův test prověřuje pouze největší hodnotu ze souboru směrodatných odchylek nebo rozpětí - jednostranný test. Nehomogenita rozptylů se však může projevit i tím, že některá ze směrodatných odchylek nebo rozpětí může být výrazně nižší proti ostatním. Toto může být výrazně ovlivněno také stupněm zaokrouhlením výsledků. Vylučovat ale výsledky, jejichž směrodatná odchylka resp. rozdíl vykazují lepší vzájemnou shodu se nezdá být logické.

3.7 Validace instrumentální

Validace jednotlivých komponent systému (hardware) je zjednodu­šena v případě, že použitá technika je certifikována podle norem řady ISO (International Organization for Standardization) 9000 - 9004. V tomto případě je testování celého systému zaručena výrobcem. V opačném případě je testování specifickou záležitostí jednotlivých komponent systému a pro ně musí být zpracován individuální validační program instrumentace.

4. Revalidace systému

Podmínky revalidace systému nejsou obecně definovatelné, protože každá změna v celém analytickém systému vede zákonitě k jeho revalidaci. Každá změna musí být však posouzena individuálně, zda má prokazatelný vliv na konečný výsledek.

V kladném případě je nutné provést revalidaci, avšak tato revalidace nemusí být komplexní, ale pouze jako dílčí krok validačního programu (např. kalibrace, citlivost) s tím, že musí být zpětně určena směrodatná odchylka (resp. Rmax) a zda tato změna nemá vliv na velikost Rmax resp. sx (viz čl.3.1.1).

Některé podmínky, které definují nutnost revalidace jsou dány již ve validačním programu.

5. Validační protokol

Validační protokol se odvolává na validační program, respektive konkrétní validační program. Do validačního protokolu se zazname­návají všechna měření, výpočty i pomocné výpočty. Výsledky a závě­ry jsou zřetelně definované. Do validačního protokolu se uvádí da­tum jednotlivých zkoušek, jméno zodpovědného pracovníka a jména dalších pracovníků, kteří se podíleli na validačním programu.

6. Literatura

Literární odkazy mohou být součástí jednotlivých článků vali­dačního programu nebo se může uvést literární odkaz jako samostat­ná příloha validačního programu.