Otravy tisem (XXIII. Mezinárodní konference o separační chemii a analýze toxických látek)

V článku je uvedena jednoduchá metoda vedoucí ke zvýšení koncentrace 3,5-dimethoxy-fenolu v nativním rostlinném materiálu nebo jeho výluhu spočívající v kyselé hydrolýze za zvýšené teploty. Tato látka je důležitým markerem při otravách tisem a je přijímána jako důkaz jeho přítomnosti. Pro analýzu byla použita metoda GC-MSD. Dva stručně popsané případy suicidálního jednání dvou mladých lidí za použití tisu jsou zajímavé především tím, že se nejedná o příliš frekventovaný způsob provedení sebevraždy, dále že v prvním případě došlo k zadokumentování sebepoškozujícího jednání pomocí videosekvencí na tablet a že se oba poškození navzájem znali.

1 Úvod

Botanický druh tis červený (Taxus baccata L.) z čeledi tisovité (Taxaceae) je jehličnatá dřevina, která se u nás vyskytuje relativně hojně ve formě keře nebo nižšího stromu především v parcích. Je všeobecně známo, že se jedná o toxickou dřevinu, která má s výjimkou červeného dužnatého nepravého míšku (epimatium) tvořícího se kolem semen v podzimním období všechny ostatní části prudce jedovaté.

Jedovaté obsahové substance (pseudoalkaloidy ze skupiny tzv. taxinů, především dominantní taxin B a isotaxin B a dále taxin A, jejichž koncentrace se může během roku poměrně významně u konkrétního botanického jedince měnit) se vstřebávají poměrně rychle (30 – 60 min) trávícím traktem a vedou ve svém účinku k zastavení srdeční činnosti (výrazný vliv na kardiovaskulární systém).

Jako letální dávka pro člověka je udáváno množství 50 – 100 gramů rostlinného materiálu (jehličí) nebo odvar z tohoto množství (1) a k smrti dochází většinou do 2 hodin po požití.

Otrava tisem je spojena s vysokou mortalitou, která je dána právě výrazným kardiotoxickým účinkem obsahových toxinů a zároveň tím, že neexistuje účinná protilátka (antidotum), která by mohla být při otravě zavčas podána.

Při prováděné pitvě může na intoxikaci tisem upozornit přítomnost rostlinných zbytků (jehličí) v trávícím systému. Pokud je však k intoxikaci použit odvar z tisu, tak chybí v trávícím traktu tento charakteristický nález. Právě v těchto případech může toxikolog při podezření na otravu tisem využít cílenou analýzu přítomnosti 3,5-dimethoxyfenolu (dále jen 3,5-DMF) jako významného markeru při otravách tisem a využívaného v posledních letech. (2, 3)

Na tomto místě je legitimní si položit otázku proč právě 3,5-DMF a nikoliv samotné principiální toxiny (především výše zmíněné taxiny A a B, isotaxin B). Odpověď je jednoduchá. Zmíněné taxiny nejsou jednak k dispozici jako standardy (žádná z renomovaných firem nabízejících certifikované standardy omamných nebo psychotropních látek, léčiv a toxických látek je nemá ve svém portfoliu) a kromě toho i jejich vlastní analýza není zcela jednoduchá (využívá se především kapalinová chromatografie ve spojení s hmotnostním detektorem, např. systém HPLC-ESI-MS-MS, po předchozí předpřípravě vzorků pomocí tenkovrstvé chromatografie TLC nebo extrakce na pevné fázi SPE).

Uvedený marker vzniká v průběhu trávícího procesu v tělních orgánech štěpením jednoho z dalších taxinů jedinečného pro tis, a to konkrétně taxikatinu - enzymaticky hydrolýzou za přítomnosti β-glukuronidasy:

PČR/KÚ: Obrázek 1 - Šipkou označeno místo štěpení taxikatinu (3,5-dimethoxyfenolová struktura nahoře vlevo)

2 Příprava vzorku a analýza

Vzhledem k tomu, že se 3,5-DMF uvolňuje převážně až v průběhu biochemického procesu, mohou vzorky s tisem obsahovat jeho nízkou koncentraci. Soudní toxikologové mají k dispozici sice rozložený taxikatin se vzniklým markerem, ale mají ho poměrně rozptýlený v tělních orgánech a tekutinách, což samozřejmě snižuje jeho koncentraci.

Naopak k pracovníkům znaleckých pracovišť PČR se může dostat poměrně koncentrovaný nativní materiál (jehličí, semena, výluhy apod.), ale s minimem rozštěpeného taxikatinu, což samozřejmě vyústí rovněž v problém s jeho nižší koncentrací. Jde tedy o to, co nejvíce rozštěpit taxikatin přítomný ve stopách před vlastní expertizou. Použití enzymatického rozkladu lze již vzhledem k možnostem pracovišť předem vyloučit.

V lidském žaludku se jako přirozená součást vyskytuje kyselina chlorovodíková produkovaná parietálními buňkami v koncentraci mezi 140 až 160 mmol/l, což přibližně odpovídá koncentraci 0,5 – 0,6 %.

V prvním kroku je tedy třeba zvolit přídavek roztoku kyseliny chlorovodíkové k odebranému vzorku zkoumaného materiálu. Vzhledem k absenci enzymů byla zvolena mnohem vyšší koncentrace kyseliny chlorovodíkové než je v žaludeční šťávě, a to cca 7 %, tedy přibližně 2N HCl (jednoduše vezmeme 1 díl koncentrované kyseliny chlorovodíkové dostupný v laboratoři o koncentraci ~35 % a smísíme jej v patřičném pořadí se 4 díly destilované vody).

K tomu, aby došlo k podpoře hydrolýzy, se ve druhém kroku vystaví směs určitý čas (min. 15 minut) působení vyšší teploty (konkrétně 80 °C, v koncentrátoru vzorků, v sušárně apod.).

Já jsem si tento proces neenzymatické hydrolýzy vedoucí k „namnožení“ 3,5-DMF přídavkem kyseliny chlorovodíkové a vystavením vyšší teplotě nazval „inkubací“, i když, na rozdíl od biologie a medicíny, tento termín není v chemii zvykem používat.

Po proběhlé inkubaci a následném ochlazení na laboratorní teplotu se přidá podíl s vodou nemísitelného extrakčního organického činidla (ethylacetát) a po vytřepání a odstředění je možné dávkovat vzorek bez derivatizace přímo do plynového chromatografu ve spojení s hmotnostním detektorem (GC-MSD).

Podmínky analýzy byly následující: přístroj Agilent 7890B / Agilent 5977B HES (GC/MSD):

• Kolona: HP-5MS (30 m x 250 μm x 0,25 μm)
• Inlet: 250 °C, Split
• Průtok (He): 1 ml/min
• Teplotní program: 60 °C (1 min) → 30 °C/min → 180 °C (0 min) → 10 °C /min → 280 °C (15 min), tj. celkem 30 minut na analýzu
• MS Source: 230 °C
• MS Quad: 150 °C
• Acquisition type: Scan

3 Výsledky analýz

U relativně čerstvých vzorků rostlinného materiálu z tisu v řádech dnů, týdnů a jednotek měsíců (a ty bývají předkládány ke zkoumání nejčastěji) je koncentrace po inkubaci znatelně vyšší, jak je patrné z následujícího obrázku 2, kde jsou porovnány vzorky bez inkubace (pouhá extrakce ethylacetátem) a s inkubací v případě jedince tisu po 2 dnech od sklizně:

PČR/KÚ: Obrázek 2 - Porovnání shodných materiálů (jehličí) z tisu bez inkubace (černě) a s inkubací (červeně) 2 dny po sklizni (koncentrace po inkubaci dle ploch píků 3,5-DMF je zde 2,75x větší)

Naopak u starších vzorků vysušeného tisu se rozdíl mezi neinkubovaným a inkubovaným tisem z hlediska sledované koncentrace 3,5-DMF postupně stírá vlivem probíhající fermentace („staření“ sušiny) vedoucí k uvolňování 3,5-DMF z taxikatinu, jak je zřejmé z následujícího obrázku 3, kde jsou porovnány vzorky z jednoho stromu (jiný jedinec než předchozí) bez inkubace (pouhá extrakce ethylacetátem) a s inkubací v případě tisu po cca 1 roce od sklizně a rozdíl je zde tedy méně výrazný:

PČR/KÚ: Obrázek 3 - Porovnání shodných materiálů (jehličí) z tisu bez inkubace (černě) a s inkubací (červeně) 1 rok po sklizni (koncentrace po inkubaci dle ploch píků 3,5-DMF je 1,35x větší)

U výluhů (extraktů) z tisu je nutné počítat s tím, že marker 3,5-DMF v nich nemusí být vůbec časem prokázán, což bývá způsobeno totálním rozkladem mnohých toxikologicky aktivních substancí během delšího stání tisového extraktu od doby skutku do doby analýzy - tento jev je již dlouhodobě popsán, kdy si mnozí výzkumníci (4, 5) všimli, že tisové extrakty jsou nestabilní v případě neutrálního nebo alkalického prostředí a klesá tím pádem i jejich toxicita - v těchto případech však je možné hledat další doprovodné látky jednodušší struktury, jakými jsou např. myrtenol a 1-okten-3-ol. (6)

4 Kazuistika

Jedny z posledních případů, které jsem na našem pracovišti řešil v souvislosti s letální intoxikací tisem v suicidálním úmyslu a s úspěchem použil výše naznačený postup, byly dva případy z roku 2018, které se udály s relativně krátkým časovým odstupem (březen 2018 a červenec 2018) a zajímavostí je i to, že oba poškození, ač nebyli propojeni příbuzenským nebo partnerským svazkem „ o sobě věděli“.

V prvním případě se jednalo o mladého muže (28 let) a za pravděpodobným motivem jeho jednání stála totální beznaděj v tzv. lepší zítřky ruku v ruce se zklamáním z vývoje dosavadního života. Při ohledání místa události byl, mimo jiného (rostlinné materiály), zajištěn i tablet iPod, který byl v době zajištění v aktivním stavu a jeho následnou prohlídkou v něm bylo objeveno celkem 26 videosekvencí zachycujících průběh vlastního sebepoškozujícího jednání. Z hlediska posuzování případu jsou významné videosekvence popisující přípravu i požití toxické rostlinné hmoty z tisu a popisující její postupné účinky na jeho organismus. Poškozený videozáznamy sám zapíná i vypíná. Bylo zjištěno, že výše popsaný soubor videosekvencí byl odeslán, ale v tabletu byly všechny cesty a komunikace odstraněny a tudíž nebylo možno je dohledat a ověřit, zda nebyl odeslán více adresátům.

Ve druhém případě se jednalo o mladou ženu (24 let), u které byla hlavním motivem jejího jednání závažná diagnóza (paranoidní schizofrenie). Stejně jako v předchozím případě bylo provedenou pitvou a následným toxikologickým rozborem zjištěno, že bezprostřední příčinou smrti mladé ženy byla otrava rostlinným jedem (směsí toxinů) z tisu. Poškozená nebyla v době smrti pod vlivem alkoholu ani jiných toxikologicky významných látek (léčiv, omamných a psychotropních látek apod.).

Dále bylo v rámci ohledání zjištěno, že se v místě vedle rostlinného materiálu nachází 2 notebooky, o kterých její matka sdělila, že jeden z nich dcera užívala a psala zde své povídky i knihu, ale před časem údajně smazala pevný disk na tomto počítači stejně jako cca 1 měsíc před událostí svůj účet na Facebooku.

Ani v tomto případě se tedy nepodařilo prokázat (ač při prověřování bylo opakovaně ke kontrole výpočetní techniky přistoupeno), že by proběhla přímá komunikace mezi poškozeným a poškozenou. Faktem však zůstává, že poškozená prokazatelně věděla, jaký toxický materiál použil rodinný známý při sebevraždě a mohla se tím i sama inspirovat. Její matka při podání vysvětlení mimo jiného uvedla: „Hodně ji vzalo, když syn od známé užil vývar z tisu a zemřel. To bylo někdy v březnu letošního roku.“

Po ukončení prověřování, při předávání zajištěných věcí otci zemřelého, tento policejnímu orgánu předložil úmrtní parte mladé ženy s tím, že zemřela stejným způsobem jako před tím jeho syn. A zde se oba velmi smutné příběhy oboustranně propojily.

5 Závěr

Ke zvýšení koncentrace („namnožení“) významného markeru otravy tisem, kterým je 3,5-DMF, byla pro vzorky obsahující materiál z tisu použita kyselá hydrolýza v prostředí kyseliny chlorovodíkové při zvýšené teplotě 80 °C. Tento způsob je vhodný zejména pro materiály relativně čerstvě sklizené. Následně popsané dva případy sebevraždy požitím rostlinných materiálů z tisu potvrzují vysokou mortalitu při tomto druhu otravy.