Rychlejší plynová chromatografie a její využití v pivovarství. Část 2. - Stanovení vysoce těkavých senzoricky aktivních látek v pivu po extrakci headspace metodou.

Jedním ze způsobů, jak reagovat na požadavky brzkého získání výsledků analytických rozborů, je použití rychlejší chromatografie. Na trhu se nedávno objevily křemenné kapilární kolony s novým rozměrem vnitřního průměru 0,18 mm. Tato práce se zaměřuje na možnosti využití právě těchto kapilárních kolon v porovnání s běžně používanými kolonami o vnitřním průměru 0,32 mm pro stanovení velmi těkavých senzoricky aktivních látek v pivu. Tyto látky byly z matrice vyextrahovány metodou headspace, k detekci byl použit plamenoionizační detektor.

1 ÚVOD

Požadavky na dnešní laboratoře zahrnují nejenom získání přesných a reprodukovatelných výsledků, ale také nutnost jejich dodání v co nejkratší době. Přitom vlastní rozbor v sobě většinou zahrnuje přípravu vzorku, následné vlastní stanovení a zpracování naměřených dat.

Při stanovení těkavých senzoricky aktivních látek v pivu se často používají plynově chromatografické metody v kombinaci s headspace technikou. Tyto postupy jsou součástí oficiálních metod řady institucí jako je EBC, MEBAK nebo IOB (1-3). Jako alternativa k headspace metodám byly vypracovány další rychlé, levné a spolehlivé postupy využívající mikroextrakci na pevné fázi k izolaci těchto látek z piva. Např. Polští autoři Jelen a kol. se zabývali porovnáním mikroextrakcena pevné fázi a headspace technikou při stanovení některých alkoholů a esterů v pivu (4). Použití mikroextrakce na pevné fázi pro stanovení dimethylsulfidu v pivu popisuje Šulák a kol. (5).

Další způsob, jak urychlit celý analytický proces, spočívá v použití rychlejší plynové chromatografie. Zájem o urychlení chromatografické separace se datuje již od prvního použití chromatografie v systému plyn-kapalina v roce 1952 (6). Teoretické a praktické možnosti současného využití rychlé chromatografie byly rozebrány v předcházejícím článku (7). Nevýhodou běžně dostupných „narrow bore“ kapilárních kolon s vnitřním průměrem 0,1 mm je nutnost vysokého tlaku na hlavě kolony (600 kPa nebo ještě vyššího), nezbytnost rychlého ohřevu chromatografické pece a požadavky na detektory s rychle skenující elektronikou. Ne všechny běžné plynové chromatografy jsou schopny vyhovět těmto zvýšeným nárokům. Proto je možné označit za vynikající nápad obohatit nabídku chromatografických kolon vnitřní průměr 0,18 mm. Jde o rozumný kompromis, který umožní jednak zkrácení plynově chromatografických analýz, ale přitom je možné využít stávající instrumentaci.

Z výše uvedeného vyplývá, že při použití velmi tenkých kolon se zásadním způsobem mění téměř všechny pracovní parametry chromatografické separace (je nutný jiný vstupní tlak, teplotní program jiný split poměr). Vzhledem k tomu, že teorie plynové chromatografie je velmi dobře popsána (8,9), byly vyvinuty programy, které umožňují “přeložit“ pracovní podmínky na stávající konvenční koloně na podmínky vhodné pro velmi tenké kolony (10,11). Díky tomu odpadá složité a hlavně časově náročné hledání nových vhodných podmínek pro separaci na novém typu kolony.

Cílem této práce bylo optimalizovat chromatografické separace na koloně s vnitřním průměrem 0,18 mm pro stanovení dimethylsulfidu a jeho prekurzorů a dále pro stanovení acetaldehydu a těkavých esterů a nižších alkoholů po extrakci headspace technikou. Parametry těchto metod včetně časových úspor jsou porovnány s charakteristikami metod získaných na konvenčních kapilárních kolonách o vnitřním průměru 0,32 mm.

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

Helium v kvalitě 5.0, vodík v kvalitě 5.0, syntetický vzduch byly dodány firmou Messer, ČR. Analýza probíhala na plynovém chromatografu Carlo Erba 5300 Mega Series s nástřikem v split modu a plamenoionizačním detektorem. K chromatografu byl připojen smyčkový headspace dávkovač Dani HSS 3950. Chromatografické kolony a pracovní podmínky jsou uvedeny dále v textu.

Dimethylsulfid, ethyldimethylsulfid, acetaldehyd, mravenčan ethylnatý, octan ethylnatý, octan propylnatý, octan isobutylnatý, máselnan ethylnatý, propanol, octan butylnatý, isobutanol, octan isoamylnatý, n-butanol, 2- a 3-methylbutanol, kapronan ethylnatý a kaprylan ethylnatý byly nakoupeny od firmy Sigma Aldrich, USA, ethanol od Lach-Ner, s. r. o., ČR, ultračistá voda – Milli-RO 5plus firmy Millipore,USA. Vzorky zakoupeného piva ležáckého typu byly před analýzou vychlazeny na 4 °C.

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Pro analýzu těkavých senzoricky aktivních látek v pivu se často používají kolony o délce 50 až 60 m s velmi vysokým počtem teoretických pater (200 000 a více), aby bylo dosaženo uspokojivého rozlišení. V naší laboratoři se používá pro rutinní analýzu konvenční kolona od výrobce J&W Scientific s fází typu DB-WAX o tloušťce filmu 0,25 μm, délce 60 m a vnitřním průměru 0,32 mm. Jako „narrow bore“ kolona byla použita kolona J&W Scientific se stejnou fází DB-WAX o tloušťce filmu 0,18 μm, délce 20 m a vnitřním průměru 0,18 mm. Pracovní podmínky pro tenkou kolonu byly vypočítány pomocí překladového software volně přístupného na internetových stránkách firmy Agilent Technologies. Podmínky měření pro oba typy kolon jsou pro stanovení dimethylsulfidu uvedeny v tab. 1. Tab. 2 uvádí podmínky měření pro stanovení acetaldehydu a dalších těkavých esterů a nižších alkoholů v pivu.

Tab. 1 Pracovní chromatografické podmínky pro stanovení dimethylsulfidu v pivu pro konvenční a velmi tenkou kapilární kolonu

Tab. 2 Pracovní chromatografické podmínky pro stanovení acetaldehydu a těkavých esterů a nižších alkoholů v pivu pro konvenční a velmi tenkou kapilární kolonu

Na obr. 1 je porovnání chromatogramů analýzy dimethylsulfidu v reálných vzorcích piv na obou kolonách. Obr. 2 ukazuje chromatografické záznamy získané z obou typů kolon při analýze piva na acetaldehyd a těkavé estery a alkoholy. Uvedené obrázky dokládají očekávanou skutečnost, že chromatografické rozlišení je na obou kolonách velmi podobné. Z uvedených chromatogramů je také jasně patrné výrazné zkrácení doby analýzy.

Obr. 1 Stanovení dimethylsulfidu v pivu A) na koloně J&W Scietific DB WAX, 60 m, 0,32 mm vnitřního průměru a 0,25 μm tloušťce filmu a B) na koloně J&W Scietific DB WAX, 20 m, 0,18 mm vnitřního průměru a 0,18 μm tloušťce filmu. 1 – dimethylsulfid, 2 – ethylmethylsulfid (vnitřnístandard)

Obr. 2 Stanovení těkavých látek v pivu A) na koloně J&W Scietific DB WAX, 60m, 0,32 mm vnitřního průměru a 0,25 μm tloušťce filmu a B) na koloně J&W Scietific DB WAX, 20 m, 0,18 mm vnitřního průměru a 0,18 μm tloušťce filmu. 1 – acetaldehyd, 2 – mravenčan ethylnatý, 3– octan ethylnatý, 4 – octan propylnatý, 5 – octan isobutylnatý, 6 – máselnan ethylnatý, 7 – propanol, 8 – octan butylnatý, 9 –isobutanol, 10– octan isoamylnatý, 11 – n-butanol (vnitřní standard), 12 – 2 a 3-methylbutanol, 13 – kapronan ethylnatý, 14 – kaprylan ethylnatý

Z retenčních časů posledního píku na chromatogramu lze určit faktor, který vyjadřuje časový zisk při použití tenké kapilární kolony. Srovnání skutečného časového zisku určeného z retenčních časů posledních píků a teoreticky vypočítaného pomocí překladového software pro obě headspace metody je uvedeno v tab. 3. Rozdíly mezi skutečnou a teoretickou hodnotou lze vysvětlit tím, že při matematickém výpočtu se neuvažuje se skutečnou délkou kolon, která se od deklarované může lišit. Zejména konvenční kolona o vnitřním průměru 0,32 mm byla mnohokrát zkracována. Pokud bychom počítali s opravdovou délkou použitých kolon, shoda by byla lepší.

Tab. 3 Porovnání skutečných a teoretických časových zisků vyjadřujících zrychlení analýzy při stanovení vysoce těkavých látek v pivu headspace metodou

Při chromatografické analýze je velmi důležité z hlediska kvalitativního rozboru, aby byly dobře reprodukovatelné retenční časy jednotlivých látek. Pro kvantitativní analýzu je podstatné, aby zůstával konstantní poměr jednotlivých látek u téhož analyzovaného vzorku. Za tímto účelem bylo provedeno sedmkrát opakované měření stejného vzorku na obou kolonách pro obě headspace analýzy. V tab. 4 jsou uvedeny retenční časy a relativní plochy (vzhledem k celkové ploše integrovaných píků) chromatografických píků. Jak je vidět z této tabulky, reprodukovatelnost, vyjádřená jako relativní směrodatná odchylka (RSD %), retenčních časů je menší než 0,4 % pro konvenční kolonu a lepší než 0,5 % v případě tenké kolony pro obě metody stanovení. Relativní směrodatná odchylka ploch jednotlivých stanovených látek vykazuje hodnoty lepší než 3 % pro konvenční kolonu lepší než 4 % pro tenkou kolonu. Rozdíly jsou tedy statisticky nevýznamné.

Tab. 4 Srovnání retenčních časů (tr) a relativních ploch sledovaných těkavých látek v pivu na obou typech kapilárních kolon

4 ZÁVĚR

Bylo dokázáno, že kapilární kolony pro plynovou chromatografii s novým rozměrem vnitřního průměru 0,18 mm je možné s úspěchem použít pro headspace stanovení velmi těkavých senzoricky aktivních látek v pivu. Tento typ kolon poskytuje v porovnání sklasickými kapilárními kolonami s vnitřním průměrem 0,32 mm srovnatelné pracovní charakteristiky a přitom vlastní čas analýzy zkracují o 65 % v případě stanovení dimethylsulfidu a o 60 % vpřípadě stanovení acetaldehydu a těkavých esterů a alkoholů. I když celková časová úspora je menší vzhledem k době nutné ke zchlazení chromatografické pece na původní teplotu – tato doba se změnou kolony nemění – i tak jde o významné zrychlení analýzy. Tím se zvyšuje kapacita laboratoře a navíc je možné využít stávajících plynových chromatografů na rozdíl od nasazení velmi tenkých kapilárních kolon s vnitřním průměrem 0,10 mm.