Automatické stanovení Δ9-Tetrahydrocannabinolu (THC) a jeho metabolitů v krevním séru pomocí SPE-GC/MS

THC je hlavní psychoaktivní látkou v rostlinách konopí. Například v Německu stačí pro odebrání řidičského průkazu stanovení koncentrace THC nad 1 ng/ml v krevním séru. Po konzumaci je THC metabolizováno na aktivní metabolit 11-hydroxy- Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC-OH) a dále pak na neaktivní metabolit 11-nor-9-carboxy- Δ9-Tetrahydrocannabinol (THC-COOH). Ze stanovených koncentrací metabolitů THC lze zjistit další zajímavé informace o užití THC – vysoká koncentrace THC-OH ukazuje na nedávné užití konopí, vysoký obsah THC-COOH pak indikuje časté užívání konopí.

Altium: Obrázek 1 - Systém pro automatickou analýzu THC a jeho metabolitů

Instrumentace

Příprava vzorků byla provedena na aparatuře Gerstel sestavené z MultiPurpose Sampler (MPS) v provedení dual head, vybaveném modulem Solid Phase Extraction (SPE) a MultiPosition Evaporation Station (mVAP). Samotné měření bylo provedeno na plynovém chromatografu Agilent 7890 a hmotnostním spektrometru Agilent 5977. Levá věž MPS byla vybavena stříkačkou o objemu 10 μL pro nástřik do inletu, zatímco pravá věž byla opatřena stříkačkou o objemu 2.5 mL pro dávkování všech rozpouštědel, kromě přídavku derivatizačního činidla N-Methyl-N-(trimethylsilyl) trifluoroacetamidu (MSTFA). Celý proces byl řízen kontrolním software Gerstel Maestro, který lze snadno integrovat do Agilent Chemstation a Agilent MassHunter. Nástřik vzorků byl realizován prostřednictvím horkého split/splitless intletu na kolonu.

Výsledky a diskuse

Jedním z kritérií bylo porovnání výsledků stávající a nové automatické metody. K tomuto účelu bylo analyzováno 5 vzorků krevního séra s přídavkem standardu THC na koncentrační úroveň blízkou detekčnímu limitu metody. Z grafu na Obrázku 3 vyplývá, že výsledky koncentrací THC jsou v souladu pro obě metody.

Altium: Obrázek 3 - Porovnání analýzy výsledků THC získaných validovanou rutinní metodou a automatickou metodou Gerstel

Dalším důležitým kritériem pro hodnocení automatické metody bylo stanovení carry-over. Bylo měřeno 6 vzorků krevního séra s přídavkem standardu na koncentrační úrovni 60 ng/ml THC, THC-OH a 600 ng/ml THC-COOH. Po každém vzorku byl změřen blank čistého séra. Jak je patrné z Obrázků 4a, 4b a 4c, u žádného ze stanovovaných analytů nebyl zjištěn měřitelný carry-over. Použitá kalibrace byla provedena nástřikem rozpouštědlových standardů. Toto bylo možno provést jednak díky přítomnosti deuterovaných interních standardů pro každý analyt, jednak díky porovnání kalibračních křivek získaných měřením rozpouštědlové a matriční kalibrační řady (oba typy poskytovaly shodné křivky).

Altium: Obrázek 4 - Opakované měření blanku po nástřiku vzorku: a) THC o koncentraci 60 ng/ml, b) THC-OH o koncentraci 60 ng/ml, c) THC-COOH o koncentraci 600 ng/ml

Pracovní postup a příprava vzorků

Manuální přípravné kroky

• 500 μL vzorku se naředí 500 μL 10% kyseliny octové a 50 μL roztoku interního standardu

• Pokud je ve vzorku viditelná sraženina, vzorek se odstředí (tento krok lze také automatizovat)

Automatizované přípravné kroky

• SPE kolonka (1 mL, 100 mg C18ec) se nakondicionuje 2 ml každého rozpouštědla v tomto pořadí

  • Methanol
  • Deionizovaná voda
  • 0.1 M kyselina octová

• Celý vzorek (0.5 ml krevního séra) se převede na nakondicionovanou kolonku

• Následně se SPE kolonka se vzorkem promyje 2 ml rozpouštědel v tomto pořadí

  • 0.1 M kyselina octová
  • Směs acetonitrilu (60/40 v/v)

• SPE kolonka se vysuší proudem dusíku po dobu 1 minuty

• Analyty se eluují 2 x 200 μL acetonitrilu

• Eluát se odpaří dosucha při 60 °C, 100 mBar a třepání (250 rpm) po dobu 5 min v modulu mVAP

• Odpařený vzorek se rozpustí ve 25 μL MSTFA při okolní teplotě, stálém míchání (750 rpm) po dobu 5 min

• 3 μL alikvot se nastříkne do horkého inletu, kde proběhne simultánní silylace analytů a transfer na GC kolonu

Altium: Obrázek 2 - Pracovní postup modulu Gerstel SPE

Podmínky GC/MS analýzy

• MPS: 3 μL injection volume
• Teplota inletu: 280 °C
• Inlet Liner: Deactivated, single taper (Agilent)
• Injection Mode: Splitless, 2 min
• Pneumatics: 134.5 kPa He, constant pressure
• Oven:
  • 160 °C (1 min); 10 °C/min;
  • 180 °C (8 min); 5 °C/min;
  • 220 °C (4 min); 15 °C/min;
  • 270 °C (5 min); 10 °C/min;
  • 300 °C (5 min)
• Post Run: 325 °C (2 min), 350 kPa
• Kolona: Agilent, VF-1ms 25 m, di = 0.2 mm, df = 0.33 μm
• Transfer Line: 300 °C
• Source Temp.: 230 °C
• MSD Mode: Selected ion monitoring (SIM)
• SIM Masses:
  • m/z (THC): 386, 371, 303
  • m/z (THC-D3): 389, 374, 306
  • m/z (THC-OH): 371, 474, 459
  • m/z (THC-OH-D3): 374, 477, 462
  • m/z (THC-COOH): 371, 473, 488
  • m/z (THC-COOH-D3): 374, 476, 491

Po srovnání manuální a automatické metody a po stanovení carry-over byly odhadnuty základní validační charakteristiky – limit detekce, limit kvantifikace, reprodukovatelnost, mezi-denní reprodukovatelnost a účinnost extrakce – viz Tabulka 1.

Altium: Tabulka 1 - Naměřené validační charakteristiky pro metodu automatického stanovení THC a jeho metabolitů v krevním séru

Závěr

Byla vyvinuta a validována plně automatická metoda pro stanovení THC a jeho hlavních metabolitů v krevním séru.

Bylo dosaženo

• limitu kvantifikace pod 1 ng/mL pro THC a THC-OH, pod 5 ng/ml pro THC-COOH
• reprodukovatelnosti výsledků měření v rozmezí 3.3 % – 10 %
• extrakční účinnosti mezi 70 % - 93 %

Tyto výsledky byly dosaženy analýzou pouze 0.5 ml vzorku krevního séra (oproti standardní manuální metodě, kde se používá celý mililitr).