Stanovení obsahu trans-2-nonenalu v zrnu ječmene, sladu a pivu

Trans-2-nonenal je aldehyd podílející se na nepříjemné chuti a vůni žluklého másla ve skladovaném pivu. Cílem této práce byla optimalizace a zavedení automatizované metody SPME-GC pro stanovení obsahu trans-2-nonenalu v pivu a pivovarských surovinách. Pro extrakci HS-SPME bylo porovnáno pět typů vláken: 100 μm PDMS, 65 μm PDMS/DVB, 85 μm CAR/PDMS, 50/30 μm DVB/CAR/PDMS, 85 μm PA. Nejvyšší výtěžnosti pro extrakci HS-SPME bylo dosaženo vláknem PDMS/DVB, doba extrakce 20 minut při teplotě 60 °C s přídavkem 1,5 g NaCl. Identifikace trans-2-nonenalu byla provedena metodou HS-SPME-GC-MS, vlastní analýza vzorků byla provedena automatizovanou metodou HS-SPME-GC-FID.

1 ÚVOD

Obilky ječmene obsahují dva typy lipidů: zásobní a funkční. Zásobní lipidy, speciálně triglyceridy slouží jako zásobárna energie při mobilizaci specifických enzymů při poškození, nákaze a dalších stresujících faktorech nebo při klíčení. Když jsou zrna ječmene poškozena nesprávným skladováním nebo jsou vystavena určitým mikroorganismům, může dojít k degradačním reakcím lipidů. Tyto reakce mohou být katalyzovány vlastními endogenními enzymy zrna nebo enzymy mikroorganismů v závislosti na environmentálních podmínkách nebo poškození. Lipasa a lipoxygenasa jsou dva hlavní enzymy ovlivňující degradaci lipidů v zrnech ječmene (1).

Hydrolýza triglyceridů je katalyzována lipasami, které jsou v zrnu vždy přítomné. Mezi nepříznivé efekty jejich aktivity patří především změny v chuti a aroma potravin, rostoucí acidita olejů a uvolnění nenasycených mastných kyselin, které jsou oxidovány lipoxygenasami (1, 2).

Specifickým substrátem lipoxygenasy je cis,cis-1,4-pentadiennová struktura, kterou je možno nalézt u mastných kyselin jako je linolová, linolenová nebo arachidonová kyselina, degraduje je buď na volné kyseliny, triglyceridy nebo methyl (ethyl) estery. Primární produkty jsou opticky aktivní cis-trans-konjugované hydroperoxidy. Tyto hydroperoxidy jsou tvořeny radikálovým mechanismem a jsou buď rozloženy, nebo dále oxidovány na sekundární produkty jako jsou alkoholy, kyseliny, ketony nebo aldehydy, které mohou nepříznivě ovlivnit nutriční hodnotu, aroma, chuť a kvalitu potraviny (1, 2).

V uskladněném pivu je základní složkou podílející se na chuti žluklého másla aldehyd trans-2-nonenal (obr. 1) (3, 4). Mechanismus tvorby trans-2-nonenalu v pivu je enzymatická nebo neenzymatická oxidace a oxidace volných mastných kyselin, kde svou roli sehrává právě lipoxygenasa (5).

Obr. 1 Aldehyd trans-2-nonenal

Vzhledem k tomu, že aldehyd trans-2-nonenal je základní složkou podílející se na změnách chuti ve skladovaném pivu, byla optimalizována metoda automatické HS-SPME-GC pro stanovení této látky v pivu a pivovarských surovinách (6, 7). Pro HS-SPME bylo porovnáváno 5 různých vláken (100 μm PDMS, 65 μm PDMS/DVB, 85 μm CAR/PDMS, 50/30 μm DVB/CAR/PDMS, 85 μm PA) (8, 9).

Analýza vzorků byla provedena metodou HS-SPDE-GC-FID s vláknem PDMS/DVB.

2 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST

2.1 Použité chemikálie a standardy

Trans-2-nonenal – Sigma, USA; ethanol – Sigma, USA; NaCl – Sigma, USA; deionizovaná voda.

2.2 Materiál a přístroje

Materiál

Pro sledování obsahu trans-2-nonenalu v obilkách ječmene, sladech a pivech bylo analyzováno celkem 54 vzorků, 21 odrůd ječmene, 21 sladů z nich vyrobených a 12 piv.

Přístroje a pomůcky

Laboratorní mlýnek na jemné mletí – Retsch, Německo; analytické váhy – Mettler Toledo, USA; chlazená centrifuga – Sigma, Německo; vialky s víčky pro head space a uzavírací kleště 20 ml – CRS, USA; plynový chromatograf Trace Ultra s FID detektorem – Thermo Scientific, USA; autosampler CombiPal – CTC Analytics, Švýcarsko; plynový chromatograf Trace Ultra s hmotnostním detektorem – Thermo Scientific, USA; kapilární kolona Supelcowax (30 m x 0,25 mm I.D., 0,25 μm) – Supelco, USA; SPME vlákna (100 μm PDMS, 65 μm PDMS/DVB, 85 μm CAR/PDMS, 50/30 μm DVB/CAR/PDMS, 85 μm PA) – Chromtech, Německo.

Pro HS-SPME extrakci trans-2-nonenalu byl optimalizován typ SPME vlákna, teplota extrakce, doba extrakce a vliv přídavku NaCl na výtěžnost extrakce. Optimalizace byly prováděny s vodným roztokem, který obsahoval 10 μg standardu trans-2-nonenalu v 5 ml. Pro extrakci bylo testováno celkem pět SPME vláken: 100 μm PDMS, 65 μm PDMS/DVB, 65 μm CAR/PDMS, 50/30 μm DVB/CAR/PDMS, 85 μm PA. Afinita jednotlivých vláken pro extrakci trans-2-nonenalu je znázorněna na obr. 2.

Obr. 2 Výběr SPME vlákna pro extrakci trans-2-nonenalu

Na obr. 3 je znázorněna závislost výtěžnosti extrakce trans-2-nonenalu na teplotě vzorku při extrakci. Největší výtěžnosti bylo dosaženo při teplotě vzorku 60 °C.

Obr. 3 Vliv teploty extrakce na výtěžnost SPME extrakce

Vliv doby extrakce trans-2-nonenalu při 60 °C je znázorněn na obr. 4. Z grafu je patrné, že největší výtěžnosti bylo dosaženo při extrakci po dobu 20 minut.

Obr. 4 Vliv doby extrakce na výtěžnost SPME extrakce

Při optimalizované teplotě a době extrakce byl sledován vliv přídavku (koncentrace) NaCl v analyzovaném vzorku na výtěžnost extrakce (obr. 5 ). Největší výtěžnost extrakce trans-2-nonenalu byla při přídavku 1,5 g NaCl do vialky se vzorkem.

Obr. 5 Vliv přídavku NaCl na plochu píku trans-2-nonenalu

2.4 Stanovení obsahu trans-2-nonenalu v obilkách ječmene a ve sladu

Do zábrusové Erlenmayerovy baňky bylo naváženo cca 5 g pomletého vzorku zrna ječmene nebo sladu, bylo přidáno 50 ml deionizované vody a po uzavření zábrusovou zátkou byl vzorek extrahován na laboratorní třepačce po dobu 15 minut. Po extrakci byl vzorek převeden do centrifugační zkumavky a za chladu byl při vysokých otáčkách centrifugován 15 minut. Do 20 ml head space vialky bylo naváženo 1,5 g NaCl a vloženo magnetické míchadlo. Do takto připravené vialky bylo napipetováno 5 ml supernatantu a vialka byla uzavřena kovovým víčkem se septem. Takto připravený vzorek byl analyzován metodou automatické HS-SPME-GC-FID.

2.5 Stanovení obsahu trans-2-nonenalu v pivu

Do 20 ml head space vialky bylo naváženo 1,5 g NaCl a vloženo magnetické míchadlo. Do takto připravené vialky bylo napipetováno 5 ml vychlazeného piva. Takto připravený vzorek byl analyzován metodou HS-SPME-GC-FID.

2.6 Instrumentace a chromatografické stanovení

Analýzy vzorků byly prováděny na plynovém chromatografu (Trace GC Ultra, Thermo Finigan) s plamenoionizačním detektorem. K separaci analyzovaných látek byla použita kapilární kolona Supelcowax (30 m x 0,25 mm I.D, 0,25 μm – Supelco, USA) s následujícím teplotním programem: počáteční teplota 50 °C po dobu 2 min, nárůst teploty 8 °C.min⁻¹ do 200 °C, setrvání 5 min. Průtok nosného plynu He byl 1,5 ml.min⁻¹. Kalibrační křivka byla lineární v rozsahu 0,03 do 3,4 μg.l⁻¹ s korelačním koeficientem 0,9998 (obr. 6).

Obr. 6 Kalibrační křivka trans-2-nonenalu

3 VÝSLEDKY A DISKUSE

Pro SPME extrakci trans-2-nonenalu byl optimalizován typ SPME vlákna, teplota extrakce, doba extrakce a vliv přídavku NaCl na výtěžnost extrakce. Nejvyšší afinitu pro extrakci trans-2-nonenalu mělo vlákno PDMS/DVB.

Na základě experimentálních výsledků byla pro stanovení obsahu trans-2-nonenalu v obilkách ječmene, sladech a pivech zvolena metoda automatické HS-SPME-GC-FID s vláknem PDMS/DVB, doba extrakce 20 minut při teplotě 60 °C s přídavkem 1,5 g NaCl. Metoda HS-SPME-GC-FID s použitím vlákna PDMS/DVB pro stanovení obsahu trans-2-nonenalu v obilce ječmene, sladu a pivu byla validována, validační parametry jsou uvedeny v tab. 1.

Tab. 1 Validační parametry stanovení trans-2-nonenalu

Pro sledování obsahu trans-2-nonenalu v obilkách ječmene, sladech a pivech bylo analyzováno celkem 54 vzorků. Z toho 21 odrůd ječmene, 21 sladů z nich vyrobených a 12 piv. Obsah trans-2-nonenalu ve vzorcích byl stanoven optimalizovanou HS-SPME-GC-FID metodou s vláknem PDMS/DVB. Obr. 7 zobrazuje ukázkový chromatogram stanovení trans-2-nonenalu ve vzorku piva metodou automatické HS-SPME-GC-FID s vláknem PDMS/DVB.

Obr. 7 Ukázka chromatogramu stanovení trans-2-nonenalu v pivu metodou automatické HS-SPME-GC-FID s vláknem PDMS/DVB

Výsledky obsahu trans-2-nonenalu ve vzorcích ječmene a sladu jsou uvedeny v tab. 2. V ječmenech se obsah tran-2-nonenalu pohyboval v rozmezí 0,28 – 3,06 μg.kg⁻¹ ve sladech v rozmezí 8,90–38,54 μg.kg⁻¹. Několikanásobně vyšší obsah trans-2-nonenalu ve sladu oproti zrnu ječmene je způsoben zvýšenou enzymatickou aktivitou při sladování.

Tab. 2 Obsah trans-2-nonenalu ve vzorcích ječmene a sladu

V tab. 3 jsou uvedeny výsledky obsahu trans-2-nonenalu ve vzorcích piva. Nejvyšší obsah trans-2-nonenalu byl zjištěn u piv nealkoholických a nejnižší obsah v pivech výčepních.

Tab. 3 Obsah trans-2-nonenalu ve vzorcích piva

4 ZÁVĚR

V 21 odrůdách ječmene, 21 sladech z nich vyrobených a 12 pivech byl stanoven obsah trans-2-nonenalu optimalizovanou metodou automatické HS-SPME-GC-FID s vláknem PDMS/DVB.

V ječmenech se obsah trans-2-nonenalu pohyboval v rozmezí 0,28 – 3,06 μg.kg⁻¹, ve sladech v rozmezí 8,90–38,54 μg.kg⁻¹. Nejvyšší obsah trans-2-nonenalu byl zjištěn u piv nealkoholických a nejnižší obsah v pivech výčepních.