Metabolic Phenotyping Using Atmospheric Pressure Gas Chromatography-MS

Význam tématu

Atmospheric pressure gas chromatography–mass spectrometry (APGC-MS) představuje měkkou ionizační techniku, která významně rozšiřuje možnosti metabolomického profilu analyzovaných vzorků. Zajišťuje konzervaci molekulárního iontu, minimalizuje fragmentaci a umožňuje přesné stanovení molekulové hmotnosti, což je klíčové pro spolehlivou identifikaci a kvantifikaci složitých biologických směsí.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat aplikaci APGC-TOF MSE pro komplexní metabolické profilování rostlinných vzorků (Arabidopsis thaliana). Autoři navrhli workflow zahrnující vytvoření referenční databáze derivatizovaných standardů, následnou analýzu biologických extraktů a vyhodnocení dat pomocí multivariační statistiky a softwaru Progenesis QI.

Použitá metodika a instrumentace

Analytická sestava:

• Gas chromatograf: Agilent 7890A GC s kolonkou HP-5MS (30 m × 0,25 mm I.D., 0,25 µm film)
• Přenos plynu: helium 1 mL/min, split 4:1, injektor 230 °C
• Teplotní program: 70 °C (start), 5 °C/min do 310 °C, držení 1 min
• APGC zdroj: SYNAPT G2-S HDMS, corona 3 µA, zdroj 150 °C, cone gas 10 L/h
• MS režim: TOF-MSE (nízká i vysoká energie 20–40 eV), m/z 50–1200
• Softwarová platforma: Progenesis QI v1.0, MassLynx v4.1

Příprava vzorku:

• Extrakce polárních metabolitů z listů Arabidopsis thaliana
• Methoximace při 45 °C/90 min a trimethylsilylace při 37 °C/30 min

Hlavní výsledky a diskuse

1. Generování referenční databáze: APGC-MSE umožnilo získat bohaté spektrum molekulárních iontů s minimální fragmentací při nízké energii a fragmenty při vysoké energii ve stejném běhu.
2. Komparace s EI: Rampování kolizní energie vedlo k fragmentačnímu spektru srovnatelnému se standardním EI, což podpořilo validitu metody.
3. Analýza rostlinných extraktů: Mapa retention time vs. m/z a integrace dat v Progenesis QI umožnily odhalit metabolické odlišnosti mezi divokým typem a mutantními liniemi (PCA, OPLS-DA).
4. Vyhledávání identifikací: Kombinace hmotnostní přesnosti, retenční doby a fragmentačního vzoru minimalizovala falešné nálezy.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká selektivita a citlivost pro komplexní směsi
• Simultánní identifikace a kvantifikace v jediném analytickém běhu
• Zrychlení workflow díky rychlému přepojení mezi UPLC a APGC
• Redukce falešně pozitivních výsledků díky orthogonálním identifikačním parametrům

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace iontové mobility a měření kolizního průřezu (CCS) pro zvýšení selektivity
• Rozšíření databází o neznámé a derivatizované metabolity
• Využití v časopisové metabolomice, environmentálních studiích a klinické analýze
• Automatizace datových analýz a strojové učení pro identifikaci vzorců

Závěr

APGC-TOF MSE v kombinaci s Progenesis QI představuje robustní a univerzální platformu pro metabolomické studie. Díky uchování molekulárních iontů, možnosti detailní fragmentace a multivariační analýze poskytuje vysokou důvěru v identifikaci a kvantifikaci širokého spektra metabolitů.