APPLICATION NOTEBOOK - UNTARGETED METABOLOMICS AND LIPIDOMICS

Význam tématu
Metabolomika a lipidomika jakožto neúčelové (untargeted) přístupy umožňují komplexní přehled o drobných molekulách a lipidech v biologických vzorcích. Díky nim lze porovnávat metabolické stavy zdravého a nemocného organismu, odhalovat biomarkery a pochopit podstatu různých fenotypových změn.
Cílem těchto metod je: rychlá a spolehlivá charakterizace tisíců sloučenin, zvýšení selektivity i citlivosti analýzy, usnadnění identifikace neznámých a nízce zastoupených metabolitů či lipidů.

Cíle a přehled studie / článku
Tento souhrnný materiál prezentuje různé inovativní platformy a přístupy společnosti Waters pro neúčelové metabolomické a lipidomické analýzy, mezi něž patří:

• HILIC UPLC/QTof MS pro separaci a rutinní screening polárních metabolitů v buňkách (např. cukry, aminokyseliny, nukleotidy).
• UPC2-MS pro rychlou, univerzální separaci lipidových tříd včetně glycerolipidů a fosfolipidů.
• Orthogonální 2D UPLC (HILIC–RP) pro zlepšení rozlišení složitých lipidomických směsí.
• LC/IMS-MS E (HDMS E) multimodální separace pro zdvojení dimenzí chromatografie, ion-mobility a hmotnostní analýzy, užitečné v metabolomice i klinické lipidomice.
• Databázový vyhledávač Progenesis QI pro usnadněné párování přesných hmotností, fragmentů a chromatografických či driftových časů.
• Integrované multi-omics workflow pro souběžné profilování metabolomů, lipidomů a proteomů v modelu lidských hepatocytů s výrazem enzymu CYP2E1.
• Metabolomické fenotypizace rostlin (brokolice) pod různými podmínkami pěstování.
• Atmosférická tlaková GC-MS E pro přesnější ionizaci a identifikaci derivatizovaných metabolitů.
• Šetření pravosti bílkovin a potravin pomocí GC-IMS a multivariačních statistik (např. basmati rýže).

Použitá metodika a instrumentace

• UPLC systémy (ACQUITY, nanoACQUITY) se sloupci HILIC BEH amide, CSH C18 i CSH Phenyl–Hexyl.
• Atmosférické tlakově řízené UPC2 systémy pro superkritickou chromatografii.
• GC-AP (7890+APGC) pro atmosférickou tlakovou GC ionizaci s měkkou chemickou ionizací.
• MS detektory – vysokorozlišující time-of-flight (SYNAPT G2, G2-S, G2-Si) s IMS (T-Wave), režimy MS E a HDMS E pro souběžný sběr presursoru i fragmentů.
• Progenesis QI (TransOmics), MassLynx, HDMS Compare a další software pro zarovnání, detekci píků, dekonvoluci, multivariační analýzu (PCA, OPLS-DA, korelace) a párování s databázemi.

Hlavní výsledky a diskuse

• HILIC-UPLC/QTof MS ukázal vynikající reprodukovatelnost retencí a lineární kalibrace (>0,99) pro polární metabolity.
• UPC2-MS umožnila rychlou (cca 6–8 min) a selektivní separaci lipidových tříd (DG, TG, PC, PE, PS, SM, Cer) v jednom běhu.
• 2D UPLC (HILIC–CSH C18) zajistila výrazné zvýšení analytické kapacity a separaci izobarických lipidů, včetně cis/trans a izomerů.
• LC/IMS-HDMS E přidalo dimenzi driftových časů, což zvýšilo čistotu fragmentačních spekter a specifitu identifikace v komplexních vzorcích (urinární omika, bakteriální a houbové modely, rostlinné výtažky).
• High-definition MS E (HDMS E) poskytl kompletní presursor-fragment párování bez potřeby DDA, vhodné pro multi-omics.
• Progenesis QI přístrojový databázový vyhledávač snížil počet falešně pozitivních identifikací díky použití orthogonálních parametrů: přesné hmotnosti, retence, drift-časů a fragmentů.
• Multi-omics integrace v hepatocytech: změny v proteomu, metabolomu a lipidomu vlivem nadexpresí CYP2E1 odhalily stresové dráhy (eIF2, mTOR).
• Broccoli sprouts: diagnostika vlivu světla a cukrů na rostlinný metabolom pomocí HDMS E a TransOmics, odhalení klíčových metabolitů ve fotosyntéze.
• APGC-MS E (GC-AP) v metabolomice: zachování molekulového iontu pro lepší složité směsi, GC-MS E poskytl vysoce čistá spektra.
• Rýže basmati: GC-AP-HDMS E ve spojení s multivariačními metodami PCA/OPLS-DA odhalil možnou falzifikaci v běžně dostupných vzorcích z trhu.

Přínosy a praktické využití metody

• Význam pro farmaceutický výzkum: screening metabolitů, biomarkerů a hodnocení toxikologie léčiv.
• Potravinářský průmysl: ověřování pravosti potravin, kontrola kvality rýže a rostlinných surovin.
• Metabolomika rostlin: optimalizace pěstebních podmínek a biotechnologické aplikace.
• Systémová biologie: integrace multi-omics pro pochopení signálních a stresových drah.
• Regulační kontrola: rychlé a robustní metody pro kvalifikaci surovin, dodržování legislativy.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření 2D Chromatografie (IEX–RP, SEC–RP) a nativní IMS-MS pro screening proteinů.
• AI-poháněné nástroje pro předpověď fragmentace a automatickou identifikaci (de-novo).
• Datové sklady a sdílení multi-omics dat v cloudu pro širší spolupráci a metaanalýzy.
• Automatizace přípravy vzorků (online SPE, robotizace) pro vysokou propustnost (HTP) screening.
• Standardizace multi-omics postupů a protokolů pro klinické nasazení a farmako-metabolomiku.

Závěr
Vývoj a aplikace moderních chromatografických separací (UPLC, UPC2, APGC) a HDMS E detekce v kombinaci s pokročilou informatikou (Progenesis QI, TransOmics) přináší nový standard pro neúčelové metabolomické, lipidomické a multi-omics studie. Umožňuje rychlou, robustní a vysoce selektivní analýzu komplexních biologických vzorků s vysokou úrovní důvěry pro kvantifikaci i identifikaci neznámých sloučenin. Tato řešení nacházejí uplatnění od farmacie, přes potravinářský průmysl až po systémy rostlinného výzkumu a klinických aplikací.

Použitá instrumentace

• UPLC systémy ACQUITY, nanoACQUITY
• UPC2 superkritická konvergenční chromatografie
• Atmosférická tlaková GC (APGC) 7890 + source upgrade
• Mass spectrometry: SYNAPT G2, G2-S, G2-Si HDMS E
• Sloupcová chemie: BEH HILIC amide, CSH C18, BEH C18, BEH 2-EP
• Software: MassLynx, Progenesis QI (TransOmics), HDMS Compare, ProteinLynx GlobalSERVER

Reference
1. Paglia G, Magnusdottir M, Thorlacius S, et al. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2012;898:111–120.
2. Mal M, Wong S. Waters App. Note 720004048en, 2011.
3. Netto JD, Wong S, Ritchie M. Waters App. Note 720004546en, 2012.
4. Arapitsas P, Franceschi P, Arapitsas N, et al. Rapid Commun Mass Spectrom. 2013;27(21):2425–2431.
5. Ritchie M, Mal M, Wong S. Waters App. Note 720004201en, 2012.
6. Shockcor JP, et al. Waters App. Note 720003349en, 2010.
7. Shulaev V, et al. J Am Soc Mass Spectrom. 2011;22(7):1146–1155.
8. Laures M, et al. Anal Chem. 2004;76(7):1621–1628.
9. Dunn WB, Erban A, Weber RJM, et al. Metabolomics. 2013;9(1 Suppl):44–66.