The fully on-line automation of MOX-TMS derivatisation for metabolomics applications

Význam tématu

Metabolomická analýza často využívá GC-MS pro vysokou reprodukovatelnost a chromatografické rozlišení. Derivatizace metodou methoximace (MOX) a následná silylace trimethylsilylovou skupinou (TMS) zásadně zlepšuje těkavost, termostabilitu a vytváří charakteristické fragmenty pro identifikaci sloučenin. Příprava v anhydrobních podmínkách a odstranění proteinů zajišťují kvalitu chromatogramu.

Cíle a přehled studie

Studie popisuje plně automatizovaný workflow precipitace bílkovin a on-line derivatizaci MOX-TMS sérových vzorků pomocí GERSTEL MPS 2 XL Dual head. Vzorky i blanky byly plně zpracovány a bez manuálního zásahu injikovány do GC/Q-TOF MS analytického systému.

Použitá metodika a instrumentace

Proces zahrnoval přidání methanolu pro precipitaci proteinů, centrifugaci (CF-200), následnou evaporaci (mVAP), methoximaci při 30 °C s interním standardem adonitol a silylaci pomocí MSTFA+1 % TMCS nebo TMSCN při 37 °C. Analýza proběhla na GC Agilent 7890B s kolonkou HP-5MS (30 m×0,25 mm×0,25 μm) v split režimu 10:1 a na Q-TOF 7200B v EI módu (35–500 m/z). Použité přístroje: GERSTEL MPS 2 XL Dual head, mVorx, mVAP a Anatune CF-200.

Hlavní výsledky a diskuse

Interní standard adonitol 5TMS vykázal RSD 1 % pro TIC a 6 % pro extrahované iontové stopy. Dekonvoluce chromatogramů nástrojem Agilent MassHunter Unknowns Analysis odhalila v blanku 1517 komponent, v sérových replikátech 2623 a 2328 komponent, přičemž 642 až 1060 mělo shody v knihovnách NIST14/Wiley7 a přibližně 30 % představovalo TMS deriváty.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaný protokol snižuje manuální zásahy, zkracuje dobu přípravy a zvyšuje reprodukovatelnost výsledků. Metoda je vhodná pro rutinní metabolomickou analýzu v biomedicínském výzkumu, klinickém testování a QA/QC aplikacích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření automatizace na další matice (např. moč, tkáně), integrace s novými derivatizačními reagenciemi a pokročilejšími dekonvolučními algoritmy. Potenciál má nasazení v high-throughput screeningových a klinických diagnostických laboratořích.

Závěr

Vyvinutý plně automatizovaný on-line protokol precipitace proteinů a derivatizace MOX-TMS pro sérové vzorky prokázal vysokou přesnost, reprodukovatelnost a robustnost. Studie demonstruje schopnost identifikovat stovky metabolitů s minimálním manuálním zásahem.

Reference

• Camilla Liscio: Chromatography Technical Note No AS164S, Anatune Ltd., 2016