A Fully Automated On-line Forensic Toxicology Solution for the Determination of Opioids in Blood by Smart SPE Clean-Up and GC-MS

Význam tématu

V forenzních toxikologických laboratořích roste počet případů při současném omezení personálních kapacit. Zkrácení doby zpracování vzorků (TAT) a zachování vysoké kvality analýz je klíčové pro spolehlivost výsledků v soudních řízeních. Plně automatizované on-line postupy kombinující smart SPE a GC-MS přinášejí rychlost, opakovatelnost a minimalizaci ručních operací.

Cíle a přehled studie

Studie se zaměřila na vývoj plně automatizovaného workflow pro stanovení čtyř forenzně významných opiátů (morphine, 6-MAM, codeine, dihydrocodeine) v krvi pomocí miniaturizované SPE (smart SPE) a GC-MS. Cílem bylo dosáhnout vysokých procent rekuperace analytů, reprodukovatelnosti a snížení spotřeby rozpouštědel.

Použitá metodika

Vzorky defibrinované koňské krve byly navážené do 2ml vialů, přidán buffer pH 6 a deuterované interní standardy (morphine-d3, 6-MAM-d3, codeine-d3, DHC-d6). Po vortexování a odstředění proběhla on-line extrakce na ITSP smart SPE cartridgích (10 mg a 30 mg). Postup:

• Podmínění cartridgí: methanol, voda, buffer pH 6
• Naložení supernatantu pod pozitivním tlakem
• Proplachy vodou, acetátovým bufferem pH 4,5 a methanolem
• Eluce: DCM/IPA/NH4OH (78:20:2 v/v/v) do sběrné vialky
• Evaporace na mVAP do sucha
• Derivatisace BSTFA + 1% TMCS a inkubace
• Přímá injekce do GC-MS

Proti klasickému postupu bylo využito softwarové funkce PrepAhead v GERSTEL Maestro pro paralelní přípravu vzorků během běhu GC.

Použitá instrumentace

Analýzu zajišťoval GERSTEL MultiPurpose Sampler 2 XT Dual Rail vybavený solventními stanicemi, smart SPE ITSP cartridgemi, vortexerem mVorx, centrifugou CF-200 a evaporací mVAP. GC-MS část tvořil Agilent 7890B spojený s MSD 5975C.

Hlavní výsledky a diskuse

Testována byla linearita, reprodukovatelnost i percentuální rekuperace. Výsledky:

• Linearity R2 >0,997 pro oba bed size (10 mg, 30 mg) i derivatisaci bez SPE
• % RSD kalibrátorů: 1–20 % (v závislosti na analytech a bed size)
• Obnovy: 90–106 % (RSD ≤10 %)
• S/N na LOQ: DHC 30, codeine 18, morphine 13, 6-MAM 8 (přijatelný CV 2 % pro nejnižší úroveň)
• LOD: DHC 9 µg/l, codeine 5 µg/l, morphine 6 µg/l, 6-MAM 3 µg/l

Automatizace vedla k drastickému snížení spotřeby rozpouštědel (až 90 %) oproti manuálnímu postupu.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaná on-line čistící SPE čistší eluát, vyšší opakovatelnost, nižší pracovní náklady a méně chlorovaných odpadů. Umožňuje analytikům soustředit se na interpretaci dat a vývoj metod.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření metody na analýzu post-mortem celkové krve a nasazení GC-MS/MS pro vyšší selektivitu a citlivost, aplikace na další skupiny drog, integrace s datovými platformami a umělou inteligencí pro automatické vyhodnocení výsledků.

Závěr

Plně automatizované on-line řešení smart SPE–GC-MS pro stanovení opiátů v krvi prokázalo vysokou robustnost, výbornou linearitu, rekuperace a snížení provozních nákladů. Metoda je vhodná pro forenzní laboratoře s vysokou propustností vzorků.

Reference

• ITSP Solutions Inc. application note, Automated Online μ SPE-LC/MS/MS for the Measurement of Basic Drugs in Blood.
• The United Kingdom and Ireland Association of Forensic Toxicologists Forensic Toxicology laboratory guidelines (2010). Science and Justice 50: 166–176.