Bioanalytical Sample Preparation

Význam tématu

Bioanalytická příprava vzorků je klíčovým krokem při kvalitativní a kvantitativní analýze biologických vzorků pomocí technik jako LC-MS/MS a GC-MS. Správně zvolená metodika zajišťuje vyšší kvalitu dat, spolehlivou identifikaci a kvantifikaci analytů, nižší limity detekce i provozní náklady. Eliminace interferencí z matrice a koncentrace analytů dovoluje získat robustní a reprodukovatelné výsledky při vysokém pracovním výkonu laboratoře.

Cíle a přehled článku

White paper popisuje přehled hlavních přístupů k přípravě biologických vzorků, rozdělených na techniky „matrix scavenging“ a cílené extrakce. Text rozebírá hlavní výhody každé metody, návaznost na konkrétní typ biologické matrice (krev, moč, pevné vzorky), a také praktické aspekty optimalizace, zrychlení a automatizace workflow. Článek upozorňuje na kompromisy mezi jednoduchostí a citlivostí a nabízí vodítka k volbě optimálního protokolu podle objemu vzorků a nároků na limity detekce.

Použitá metodika a instrumentace

Metodiky:

• Dilute & Shoot (D&S)
• Filtrace 0,2–0,45 µm
• Proteinová precipitace (PPT) s acetonitrilem
• Odbourání fosfolipidů (PLD) adsorpčním sorbentem
• Dual Mode Extraction (DME) s in situ hydrolysou
• Liquid-Liquid Extraction (LLE) a Supported Liquid Extraction (SLE)
• Siliciumová a polymerní Solid Phase Extraction (SPE) a micro-SPE

Instrumentace:

• Kapalinová chromatografie spojená s tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS/MS)
• Gas chromatografie s hmotnostní spektrometrií (GC-MS)
• Manuální i automatizované vakuové a pozitivně tlakové manifoldy pro SPE/micro-SPE
• Centrifugy pro PPT v 96-well formátu
• Vakuové koncentrátory a aparatury pro odpařování a re-konstituci

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza ukázala, že základní techniky jako D&S a filtrace jsou nejrychlejší a nejlevnější, ale mají omezenou schopnost odstraňovat interferující složky matrice a zpravidla snižují citlivost. PPT a PLD přináší rychlý odběr proteinů a fosfolipidů, ale vyžadují dodatečnou filtraci či centrifugaci. DME s hydrolytickým krokem je účinné pro moče, kde umožňuje současnou dekonjugaci, precipitaci a adsorpční očistu v jedné „in-well“ proceduře. Klasické LLE je řadou laborantů stále využíváno pro nízké počty vzorků, ale obtížně se automatizuje. Modernější SLE usnadňuje paralelní a automatickou extrakci a minimalizuje tvorbu emulzí. SPE a micro-SPE nabízejí nejčistší extrakty s vysokým soustředěním analytů, vhodné pro nízké detekční limity, ovšem při vyšší náročnosti metodického vývoje.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká kvalita a reprodukovatelnost dat díky odstranění interferujících složek matrice
• Snížení provozních nákladů a údržby LC-MS/MS přístrojů díky „čistým“ extraktům
• Možnost dosáhnout nízkých limitů detekce koncentrací analytů pomocí micro-SPE bez nutnosti odpařování
• Zrychlení workflow a zmenšení variability robustními 96-well postupy s využitím tlakových či vakuových manifold
• Flexibilita při zpracování různých biologických vzorků (moče, plazma, krev, pevné matricové vzorky)

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávají se další inovace v oblasti plně automatizovaných a integrovaných systémů kombinujících přípravu vzorku s chromatografickou analýzou. Důraz se bude klást na minimalizaci manipulace se vzorky, možnost in-well reakcí (hydrolysa, derivatizace) a okamžité přímé připojení k hmotovým spektrometrům. Dalším směrem je vývoj sorbentů pro cílené odstraňování stále širší škály interferencí a implementace inteligentních softwarových nástrojů pro řízení kvality přípravy a interpretaci dat.

Závěr

Pečlivá volba a optimalizace metodiky přípravy vzorků je klíčová pro úspěšnou biochemickou analýzu. V praxi neexistuje univerzální postup: kritéria výběru zahrnují požadavky na limity detekce, počet vzorků, dostupnost automatizace, typ vzorku a rozpočet laboratoře. Porozumění kompromisům mezi jednoduchostí, rychlostí, čistotou extraktu a náklady pomůže laboratořím dosáhnout konzistentních, citlivých a robustních výsledků.

Reference

• Chromedia. Total ion chromatograms (TICs) and matrix effects. 2020. http://www.chromedia.org/chromedia?waxtrapp=wptlvLsHiemBpdmBlIEcCKDnC