METODIKA PRO STANOVENÍ CELKOVÉHO MNOŽSTVÍ FENOLICKÝCH LÁTEK, FLAVONOIDŮ A ANTIOXIDAČNÍ KAPACITY ROSTLINNÝCH VZORKŮ POMOCÍ KOMBINOVANÉ EXTRAKCE

Význam tématu

Fenolické sloučeniny a flavonoidy představují klíčové sekundární metabolity rostlin, které se podílejí na neutralizaci reaktivních forem kyslíku a obraně proti abiotickému i biotickému stresu. Stanovení celkového obsahu těchto látek spolu s antioxidační kapacitou je důležité pro výzkum rostlinných adaptačních mechanismů, hodnocení kvality potravin a vývoj nových agrotechnologií. Kombinovaná extrakce z jednoho vzorku minimalizuje spotřebu materiálu, zrychluje analýzy a umožňuje komplexní charakterizaci vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout metodiku umožňující ze stejného rostlinného vzorku v destičkovém formátu stanovit:

• celkový obsah fenolických sloučenin (TPC),
• celkový obsah flavonoidů (TFC),
• celkovou antioxidační kapacitu (TAC),
• následnou cílenou analýzu vybraných flavonoidů pomocí GC-MS.

Metodika je demonstrována na listech jahodníku vystavených stresu ze sucha versus kontrola.

Použitá metodika a instrumentace

Rostlinný materiál (10 mg lyofilizovaných listů) se extrahoval směsí MTBE:methanol (3:1, v/v) při 4 °C (90 min, 1 000 rpm). Po centrifugaci se supernatant rozdělil na polární a nepolární fázi. TPC se stanovilo reakcí s Folin–Ciocâlteu činidlem (absorbance 760 nm), TFC reakcí s NaNO₂–AlCl₃–NaOH (510 nm) a TAC phosphomolybdenanovým testem (695 nm) v 96jamkové destičce. Komplementárně proběhla derivatizace vzorku (methoxymethyl + silylace) a analýza vybraných flavonoidů (kaempferol, quercetin) na Trace 1300 GC – Q Exactive™ Orbitrap GC-MS.
Instrumentace:

• Kulový mlýn Retsch Mixer Mill MM 400
• ThermoMixer comfort (Eppendorf)
• Spektrofotometr Tecan Infinite® M1000 Pro (96well destičky)
• Vakuový koncentrátor Speed-Vac (Thermo Fisher)
• GC-MS Trace 1300 + Q Exactive™ GC-MS/MS (Thermo Fisher)

Hlavní výsledky a diskuse

U jahod vystavených suchu došlo k přibližně 50% poklesu TPC, TFC a TAC oproti kontrole. GC-MS analýza prokázala significantní snížení kaempferolu a quercetinu, což potvrzuje výsledky spektrofotometrie. Metodika prokázala vysokou reprodukovatelnost a citlivost pro sledování stresových změn v sekundárních metabolitech.

Přínosy a praktické využití metody

• Snížení spotřeby vzorku a činidel (destičkový formát).
• Zrychlení a automatizace analýzy velkého počtu vzorků.
• Komplexní extrakce polarních i nepolarních složek, včetně proteinů a nukleových kyselin v peletu.
• Možnost následných cílených analýz pomocí LC-MS nebo GC-MS.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodiku lze rozšířit o stanovení antokyanů, fotosyntetických pigmentů a karotenoidů. Integrace s omickými přístupy (metabolomika, proteomika) umožní detailní časové studie stresových reakcí. Automatizace a miniaturizace dále zvýší výtěžnost a propustnost analýz.

Závěr

Vyvinutá kombinovaná extrakční metodika v destičkovém formátu umožňuje efektivní stanovení TPC, TFC a TAC z jednoho rostlinného vzorku s minimální spotřebou materiálu. Současné využití spektrofotometrie a GC-MS potvrzuje spolehlivost a univerzálnost postupu pro široké uplatnění v rostlinné biologii, zemědělské praxi i průmyslové kvalitativní kontrole.

Reference

1. Mittler R.: Trends Plant Sci. 22, 11 (2017).
2. Černý M. et al.: Int. J. Mol. Sci. 19, 2812 (2018).
3. Dufková H. et al.: Molecules 24, 4270 (2019).
4. Berková V. et al.: Front. Plant Sci. 11, 590337 (2020).
5. Fujita M., Hasanuzzaman M.: Antioxidants 11, 925 (2022).
6. Dumanović J. et al.: Front. Plant Sci. 11, 552969 (2021).
7. Xu M., Rao J., Chen B.: Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 60, 740 (2020).
8. Falcioni R. et al.: Front. Plant Sci. 9, 1391 (2018).
9. Sarmiento-López L. G. et al.: Biocatal. Agric. Biotechnol. 31, 101889 (2021).
10. Tanase C. et al.: Polyphenols in Plants, Academic Press (2019).
11. Singh A. K. et al.: Mol. Biol. Rep. 47, 1459 (2020).
12. Ahmed U. et al.: Molecules 26, 5546 (2021).
13. Hampejsová R. et al.: Front. Plant Sci. 13, 2295 (2022).
14. Ziani B. E. C. et al.: Food Res. Int. 116, 312 (2019).
15. Shen N. et al.: Food Chem. 383, 132531 (2022).
16. Z López-Fernández O. et al.: Antioxidants 9, 479 (2020).
17. Ma D. et al.: Plant Physiol. Biochem. 80, 60 (2014).
18. Valledor L. et al.: Plant J. 79, 173 (2014).
19. Salem M. A. et al.: Plant J. 103, 1614 (2020).
20. Cerny M. et al.: Front. Plant Sci. 13, 1018272 (2022).
21. López-Hidalgo C. et al.: Plant, Cell Environ. 44, 1977 (2021).
22. Berkoá V. et al.: Int. J. Mol. Sci. 24, 5454 (2023).
23. Berkoá V. et al.: Plants 11, 2931 (2022).
24. Pino L. K. et al.: Mass Spectrom. Rev. 39, 229 (2020).
25. Abid G. et al.: Plant Biosyst. 155, 797 (2021).
26. Mansour E. et al.: Agric. Water Manage. 247, 106754 (2021).
27. Gharibi S. et al.: Appl. Biochem. Biotechnol. 178, 796 (2016).
28. Shin Y. K. et al.: Horticulturae 7, 238 (2021).
29. Wróbel M. et al.: Acta Physiol. Plant. 27, 313 (2005).
30. Sarker U., Oba S.: BMC Plant Biol. 18, 1 (2018).
31. Kårlund A. et al.: J. Sci. Food Agric. 97, 2182 (2017).
32. Dufková H. et al.: Plants 11, 61 (2021).
33. Aryal S. et al.: Plants 8, 96 (2019).
34. Niroula A. et al.: Int. J. Food Prop. 22, 427 (2019).
35. Shin Y. K. et al.: Agronomy 10, 1627 (2020).