Sample preparation for mass spectrometry

Význam tématu

Masová spektrometrie proteinů je klíčová pro analýzu proteomu v biomedicínském výzkumu i farmaceutické charakterizaci. Kvalita a reprodukovatelnost výsledků MS analýzy jsou výrazně ovlivněny etapou přípravy vzorku. Optimalizované workflow pro izolaci, digesci, obohacení a čištění proteinů či peptidů zabezpečují vyšší citlivost, přesnost kvantifikace a konzistenci mezi experimenty.

Cíle a přehled článku

Článek shrnuje rozsáhlou nabídku řešení Thermo Scientific™ Pierce™ pro MS přípravu vzorků zahrnující:

• metody buněčné lyze a extrakce proteinů,
• depleci vysoce abundantních proteinů v biologických matricech,
• enrich­ment fosfoproteinů a cílené obohacení enzymových tříd pomocí aktivních sond,
• čištění proteinů/peptidů a koncentrační/dialyzační postupy.

Použitá metodika a instrumentace

Prvním krokem je účinná buněčná lyze s použitím speciálních pufrů a inhibičních koktejlů proteáz a fosfatáz, podpořená sonikací nebo nukleázou. Proteinová extrakce je následně optimalizována pro různé druhy vzorků (buňky, tkáně, biofluida).
Dále se uplatňují:

• spin-kolony s imobilizovanými protilátkami pro depleci albuminu/IgG nebo top-12 abundantních proteinů z plasmy,
• IMAC sloupce pro obohacení fosfoproteinů,
• magnetické částice Protein A/G či Streptavidin pro cílené imunoprecipitace a pulldowny biotinylovaných protilátek,
• aktivní sondy (desthiobiotin-ATP/ADP/GTP, fluorofosfonáty) pro selektivní značení a zachycení enzymových aktivních míst (kinázy, GTPázy, serinové hydrolázy).

Cílené obohacení je odhalováno Western blotem nebo fluorescenčním skenováním gelů, pro kvantitativní analýzu se používá LC-MS/MS na Orbitrap, Q Exactive či triple quad instrumen­taci.

Použitá instrumentace

• Orbitrap Fusion/Elite, Q Exactive, TSQ Quantiva MS
• KingFisher magnetické stationy
• MALDI matrice a LC/MS-grade rozpouštědla
• Zeba desaltingové kolony, dialyzační destičky, spin-filtry

Hlavní výsledky a diskuse

Použitím optimalizovaných kitů se dosahuje:

• konzistentně vysokého výtěžku proteinů a digestů (<10 % missed cleavages, >99 % redukce disulfidů, <1 % over-alkylace),
• vícenásobného zvýšení počtu identifikovaných proteinů/peptidů po depleci abundantních proteinů (Top2/Top12),
• účinného obohacení fosfoproteinů s minimem nespecifického vazby (prokázáno na HeLa, NIH 3T3 a myší tkáních),
• selektivnímu zachycení kináz, GTPáz i serinových hydroláz s možností profilování inhibitorů a off-targetů.

Přínosy a praktické využití metody

• Standardizovaná řešení redukují dobu vývoje metod a laboratorního ladění,
• vysoká reprodukovatelnost výsledků mezi laboratořemi,
• kompatibilita s různými MS platformami zrychluje workflow pro discovery i cílenou analýzu,
• magnetické a spin-formáty umožňují škálovat od jednoho vzorku až po HTS v 96-well formátu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj:

• nových aktivitních sond pro širší třídy enzymů a PTM,
• inteligentních kitů kombinujících multiplexní značení pro simultánní více-parametrové analýzy,
• automatizovaných linek pro přípravu vzorků a spojení s AI-based datovou analýzou,
• užití v klinické proteomice pro biomarkerové studie a personalizovanou medicínu.

Závěr

Komplexní portfolio Thermo Scientific Pierce reagencií a kitů pro přípravu vzorků významně zvyšuje kvalitu, citlivost a reprodukovatelnost MS-proteomických analýz. Modularita metod pokrývá široká spektra vzorků a aplikací, od buněčných lyzátů až po klinickou plasmu. Integrované workflow snižují variabilitu, zkracují čas a snižují náklady na výzkum proteomiky.

Reference

• Wisniewski JR a kol. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nat Methods. 2009;6:359–60.
• Bereman MS, Egertson JD, MacCoss MJ. Comparison between procedures using SDS for shotgun proteomic analyses of complex samples. Proteomics. 2011;11:2931–5.