Cell-Wide Survey of Amide-Bonded Lysine Modifications by Using Deacetylase CobB

Význam tématu

Modifikace post-translačního lyzinu představují klíčové regulační mechanismy v buňce, ovlivňující strukturu chromatinů, transkripci, metabolismus i signalizaci. Vzhledem k chemické rozmanitosti amide-vazebných modifikací lyzinu (acetylace, propionylace, succinylace, crotonylace aj.) roste potřeba vyvinout systematický postup pro jejich komplexní detekci a kvantifikaci na úrovni celého proteomu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vytvořit univerzální protokol, který využívá nespecifickou amidázovou aktivitu deacetylázy CobB ze Salmonella enterica k uvolnění všech amide-vazebných modifikací lyzinu z denaturovaného proteomu lidských buněk či tkání. Uvolněné modifikátory jsou následně analyzovány metodami kapalné a plynové chromatografie spojené s hmotnostní spektrometrií (LC/MS, GC/MS).

Použitá metodika a instrumentace

Laboratorní postup lze rozdělit do několika fází:

• Izolace proteomu z lidských hepatocelulárních buněk (HCC) nebo HEK293T buněk, frakcionace na cytosol, jádro a mitochondrie.
• Denaturace a opakované promývání 85 % acetonu pro odstranění nekovalentně vázaných metabolitů.
• Incubace proteomu s rekombinantním CobB (poměr proteom:CobB 100:1) ve fosfát-HEPES pufru s MgCl₂ a NAD⁺, ukončení methanolem se skrytým standardem (adonitol).
• Separace CobB-uvolněných metabolitů centrifugací a vysušení vzorku.
• Derivatizace: pro LC/MS příprava butylesterů (HCl/1-butanol), pro GC/MS oximace (methoxyamin/pyridin) a silylace (MTBSTFA/pyridin).
• Analytika: HPLC-MS s iontovou pářovou chromatografií (HFBA), dvoukanálové UPLC se střídavou regenerací kolon; GC-MS na HP-5MS kolóně v režimu EI 70 eV.
• Rekombinantní exprese CobB v E. coli BL21(DE3), purifikace na Ni-NTA sloupci a desalting FPLC.

Hlavní výsledky a diskuse

Demonstrací amidázové aktivity CobB na syntetických peptidových substrátech autoři prokázali schopnost odštěpit acetyl, propionyl, succinyl i crotonyl skupiny z lyzinových zbytků. Aplikací protokolu na lidský proteom identifikovali přes 40 známých i dosud nepopisovaných amide-vazebných modifikací. Kvantitativní srovnání podmínek s CobB a bez CobB odhalilo dynamické změny vybraných modifikací. Autoři diskutují možná omezení: potenciální nespecifita CobB vůči jiným amidovým vazbám a možné falešně pozitivní signály v případě neúplného promytí proteomu.

Přínosy a praktické využití metody

Protokol nabízí:

• Komplexní průzkum amide-vazebných PTM lyzinu v různých buněčných typech a tkáních.
• Možnost kvantitativního sledování dynamiky vybraných modifikací.
• Jednotný analytický workflow pro LC/MS i GC/MS.
• Potenciál integrace do laboratorní praxe při výzkumu PTM a biomarkerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření metodiky:

• Inženýrství CobB nebo jiných amidáz pro zvýšení specificity.
• Automatizace přípravy a integrace s proteomickými platformami.
• Adaptace postupu na jiné kovalentní modifikace (ubikvitinace, glykozylace apod.) pomocí specifických enzymů.
• Využití ve vývoji farmak a klinických studiích k mapování PTM za patologických podmínek.

Závěr

Prodaný postup demonstruje životaschopnou cestu k celobuněčnému průzkumu amide-vazebných modifikací lyzinu. Kombinace CobB-amidázové aktivity a cílených metabolomických analýz otevírá nové možnosti při zkoumání a kvantifikaci PTM, podporuje hlubší pochopení regulačních sítí a rozšiřuje nástroje analytické chemie v proteomice.

Reference

Wei Y., Yang W.-J., Wang Q.-J., Lin P.-C., Zhao J.-Y., Xu W., Zhao S.-M., He X.-D. Cell-Wide Survey of Amide-Bonded Lysine Modifications by Using Deacetylase CobB. Biological Procedures Online. 2019;21:23. doi:10.1186/s12575-019-0109-x.