Utilization of Statistical Compare Software and Fisher Ratios Prior to Multivariate Analysis for Complex GCxGCTOFMS Data in Order to Define Statistical Variation Between the Small Molecule Metabolite Profiles of Different Fish Species

Význam tématu

Komplexní metabolomika vyžaduje vysoce rozlišovací analytické metody a účinnou statistickou redukci dat k identifikaci klíčových malomolekulárních metabolitů. Dvourozměrná chromatografie GCxGC kombinovaná s rychlým hmotnostním spektrem TOFMS umožňuje rozlišení tisíců píků v biologických vzorcích. Předběžná statistická analýza pomocí modulu Statistical Compare a výpočtu Fisherova poměru usnadňuje odhalení nejvýznamnějších rozdílů mezi vzorky před aplikací složitých multivariačních metod.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo porovnat malomolekulární metabolitové profily muskulatury dvou druhů ryb – White Lake Perch a Lake Michigan Lake Trout – a vyvinout jednoduchý workflow pro extrakci, derivatizaci a statistické zpracování výsledných dat. Studie kladla důraz na rychlost přípravy vzorků, datovou redukci a objektivní odlišení klíčových složek metabolomů.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava vzorků: 2,5 g svalové tkáně, úprava pH na 2, extrakce methylenchloridem, sušení dusíkem, derivatizace MTBSTFA
• Chromatografie GCxGC: Agilent 7890 s dvoustupňovým kryogenním modulátorem, sekundární pec; primární kolona Rxi-5ms 30 m×0,25 mm×0,25 µm, sekundární BPX-50 1,25 m×0,10 mm×0,10 µm; helium 1,0 mL/min
• TOFMS: LECO Pegasus 4D, rozsah 40–750 m/z, 150 spekter/s, iontová komora 230 °C, detektor 1800 V
• Software: ChromaTOF pro dekonvoluci, Statistical Compare a výpočet Fisherova poměru; Miner3D pro PCA a K-means clustering

Hlavní výsledky a diskuse

V průměru bylo detekováno přes 1900 píků při poměru signál/šum >200. Funkce Statistical Compare umožnila seskupit vzorky do dvou tříd a provést zarovnání dat. Výpočet Fisherova poměru odhalil analyty s nejvyšší variabilitou mezi druhy. Dvourozměrná PCA společně s K-means clusteringem identifikovala deset metabolitů charakteristických pro White Lake Perch a tři pro Lake Michigan Lake Trout. Mezi klíčové rozdíly patří až stonásobně vyšší obsah linolenové kyseliny v perchách.

Přínosy a praktické využití metody

Navržený přístup umožňuje:

• efektivní redukci rozsáhlých datových sad a prioritizaci nejvýznamnějších metabolitů
• nezávislé odlišení složitých biologických vzorků
• aplikaci v potravinářské analýze, environmentálních studiích, klinické metabolomice a QA/QC laboratořích

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření workflow o pokročilé metody strojového učení (PLS-DA, LDA), integrace s dalšími omickými daty, plná automatizace datových pipeline a aplikace ve venkovním monitoringu či klinickém výzkumu.

Závěr

Komplexní kombinace GCxGC-TOFMS s nástroji Statistical Compare, Fisherova poměru a multivariační analýzy představuje efektivní postup pro odhalení významných rozdílů v metabolitových profilech komplexních biologických vzorků. Navržené řešení poskytuje robustní platformu pro široké spektrum aplikací v analytické chemii.