Small Molecule Metabolite Identifications in Diabetic Versus Non-Diabetic Urine Sample Groups Using Comprehensive Two-Dimensional Gas Chromatography Combined with Time-of-Flight Mass Spectrometry (GCxGC-TOFMS)

Význam tématu

Analýza malých molekulových metabolitů v biologických matricích, jako je moč, je klíčová pro pochopení biochemických změn souvisejících s onemocněními, například diabetem. Vysoká komplexita těchto vzorků si vyžaduje metody s vynikající separační schopností a citlivou detekcí, aby bylo možné odhalit i stopové složky.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo porovnat metabolitový profil močových vzorků diabetických (typ I a II) a non-diabetických subjektů pomocí kombinace dvoudimenzionální plynové chromatografie (GCxGC) a časově-of­flight hmotnostní spektrometrie (TOFMS). Konkrétními úkoly bylo:

• ilustrace rozšířené detekovatelnosti a rozlišení malé molekulární profilu,
• demonstrační využití TOFMS pro sběr hustých datových bodů a odhalení stopových analy­tů,
• ukázka výpočtu Fisherova poměru jako nástroje pro statistické rozlišení diabetických a kontrolních skupin.

Použitá metodika

Močová měření proběhla na vzorcích odebraných ráno nalačno od čtyř osob (2 non-diabetické kontroly, 1 typ I, 1 typ II). Každý vzorek byl acidifikován na pH 2, extrahován methylenchloridem a derivatizován N,O-bis(trimethylsilyl)-trifluoroacetamidem (BSTFA) v přítomnosti pyridinu při 60 °C po dobu jedné hodiny.

Použitá instrumentace

Analýza byla provedena na systému LECO Pegasus 4D s Agilent 7890 GC, dvoustupňovým kryogenním modulátorem a sekundárním GC panelem. Primární kolona Rtx-5ms (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm), sekundární kolona Rtx-200 (1,5 m × 0,18 mm × 0,18 µm). Program teplot: primární 40 °C (1 min) → 6 °C/min → 290 °C (10 min); sekundární 50 °C (1 min) → 6 °C/min → 300 °C (10 min). Helium 1,5 mL/min, modulace 5 s. TOFMS sběr dat v rozsahu 45–800 m/z rychlostí 200 spekter/s, ionizační energie −70 eV, iontové zdroje na 230 °C, detektor 1750 V. K řízení a zpracování dat sloužil software ChromaTOF s funkcí Sample Groups a Fisher Ratio.

Hlavní výsledky a diskuse

Průměrně bylo identifikováno více než 1000 špiček na vzorek se signál-šum ≥ 100. GCxGC umožnila rozlišení koeluovaných sloučenin, což ilustrují příklady pěti blízko elujících metabolitů dekonvoluovaných TOFMS. Statistická analýza pomocí funkce Sample Groups a výpočtu Fisherova poměru zdůraznila klíčové rozdíly mezi diabetickými a kontrolními vzorky.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká kapacita separace a citlivá detekce stopových metabolitů,
• nepřetržitý full-range záznam spekt­r připravený k postprocessingu a identifikaci,
• rychlá identifikace chemických markerů pomocí Fisherova poměru podporuje objev biomarkerů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Spojení GCxGC-TOFMS s algoritmy strojového učení a pokročilou modulací slibuje další zvýšení rozlišení a automatizace. Tato kombinace podpoří rutinní vyhledávání nových biomarkerů pro včasnou diagnostiku a monitorování léčby.

Závěr

GCxGC-TOFMS se prokázala jako robustní nástroj pro komplexní profilaci malých molekul v biologických vzorcích. Díky vysoké separační schopnosti, rychlé akvizici dat a statistické analýze lze odhalit a kvantifikovat metabolické změny související s diabetem, což prodlužuje možnosti výzkumu biomarkerů.