BioPharmaceutical approach with spectroscopy

Význam tématu

V biotechnologickém a biopharmaceutickém průmyslu roste potřeba rychlých, nedištruktivních a validovatelných analytických nástrojů pro kontrolu surovin, průběžné monitorování procesů a finální kontroly kvality. Vibrationalní spektroskopie (FTIR, NIR, Raman) a UV‑Vis spektrometrie nabízejí doplňující informace: identifikaci a kvantifikaci bílkovin, monitorování surovin a procesu (PAT), detekci agregací a podporu strategií pro real‑time release. Tyto techniky šetří čas i materiál, umožňují automatizaci rozhodování a snižují závislost na offline laboratorních analýzách, což je zvláště důležité pro regulované výrobní linky biologik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem kompendia je demonstrovat praktické nasazení molekulárních spektroskopických metod v biopharmaceutickém workflow: od identifikace a kvality surovin, přes monitorování upstream a downstream procesů až po finální kontrolu produktu. Obsahuje aplikační poznámky věnované: určení sekundární struktury proteinů pomocí FTIR (transmise a ATR), použití procesního Raman spektrometru pro automatizované řízení zásobování glukózou ve fed‑batch bioreaktorech, přenos metod mezi Raman instrumenty, predikci koncentrace proteinu v buněčných kulturách FT‑NIR, detekci proteinových agregátů UV‑Vis, kontrolu čistoty DNA (NanoDrop), kvantifikaci proteinů při 205 nm, sledování plasmonického posunu zlatých nanoskel po biokonjugaci a použití procesního Raman pro downstream práce s pufry a real‑time release.

Použitá metodika a instrumentace

• FTIR: Thermo Scientific Nicolet iS10 / iS50 (DTGS / MCT detektory), Smart OMNI‑Transmission, BioCell CaF2, ConcentratIR2 ATR; analytický software OMNIC a PROTA‑3S pro dekonvoluci a databázovou kalkulaci sekundárních struktur.
• NIR: Thermo Scientific Antaris MX FT‑NIR Process Analyzer, transflectance sondy s nastavitelnou optickou délkou; chemometrie PLS v TQ Analyst.
• Raman (procesní a laboratorní): Thermo Scientific MarqMetrix All‑In‑One Process Raman Analyzer s BallProbe a FlowCell optikami; DXR3 SmartRaman+; MarqMetrix + TruBio a Lykos software; datová zpracování v Python, SOLO a TQ Analyst; PLS chemometrie, Savitzky‑Golay filtr, SNV, L1 norm, LOOCV, VIP, Hotelling T2, Q‑residuals.
• UV‑Vis: Thermo Scientific Evolution One Plus a Evolution ISA‑220 (integrating sphere), NanoDrop One / Lite / Eight / Ultra (microvolume spektrofotometry) s Acclaro Sample Intelligence pro korekci kontaminantů.
• Další: HPLC/LC‑MS pro referenční analýzy, agarózová elektroforéza, vzorkovací příslušenství (vial holder, cuvetty), metody filtrací/gel‑extraction.

Hlavní výsledky a diskuse

• FTIR sekundární struktura: Transmission a ATR FTIR + PROTA‑3S a OMNIC umožnily určení procentuálního zastoupení α‑helixu, β‑sheet a náhodných struktur u proteinů (příklady: cytochrom C, concanavalin A, BSA). ATR je vhodná pro nízké koncentrace/limitované množství vzorku; dekonvoluce amide I po 2. derivaci zlepšuje rozlišení komponent.
• Automatizovaná glukóza v fed‑batch (procesní Raman): integrace MarqMetrix Raman → automatická jednorázová denní bolus dávka glukózy řízená PLS modelem. Model pro glukózu: RMSECV ~0.49 g/L, RMSEP ~0.45 g/L, R²CV ~0.94; lactát: RMSEP ~0.24 g/L. Automace uchovala profily laktátu a titeru bez negativního vlivu a eliminovala offline analytiku.
• Přenos metod mezi Raman instrumenty: přímý transfer je nejrychlejší, ale citlivý na posuny vlnových čísel a rozdílné intenzity. Global (full) metoda dává nejlepší výsledky, ale vyžaduje data ze všech přístrojů. Korekční/standardizační přístupy (málo vzorků na sekundárních přístrojích) mohou být efektivní kompromis. Příklad: acetaminofen – změna spektrálních regionů významně zlepšila přenositelnost.
• FT‑NIR predikce proteinu v kulturách: Antaris MX FT‑NIR předpověděl koncentrace proteinů (model na 54 kalibračních a 20 validačních spektr) v rozmezí 0.16–5.0 g/L s RMSEP 0.31 g/L a R≈0.98; metoda vhodná pro inline nebo at‑line monitoring produkce proteinu v živých kulturách.
• Detekce agregací UV‑Vis: agregáty scatterují světlo → celé spektrum vykazuje artefakt. Pro mírné scatterování lze použít matematickou korekci (fit λ⁻4 vztahu); pro silně turbické vzorky je integrating sphere (Kubelka‑Munk transformace) spolehlivější – umožňuje kvantifikaci nezagregovaného proteinu po filtraci (příklad BGG: potvrzení množství volného proteinu 0.20–0.54 mg/mL po agregaci).
• QC DNA pro klonování (NanoDrop Lite Plus): fenol a EDTA výrazně ovlivňují A260 i A230/A280 poměry; kontaminace může inhibovat restrikční enzymy (ukázáno na pUC19); doporučení: kontrola čistoty před restrikcí a po gel‑extrakci, případné doplnění precipitačními kroky.
• A205 kvantifikace proteinů (NanoDrop One/Ultra): tři přístupy – ε205=31 pro peptidy bez aromatických zbytků, Scopes (korekce přes A280/A205), a sekvenčně‑specifický výpočet; metoda nese vyšší citlivost než A280, ale závisí na absorpci pufrů v <220 nm.
• Zlaté nanoshelly: NanoDrop One sledoval červený posun SPR po biokonjugaci (např. z ~795 → ~804 nm) při vysokých koncentracích bez nutnosti ředění, jen 1–2 µL vzorku; vhodné pro rychlou kontrolu navázání siRNA/PEG.
• NanoDrop Eight + Acclaro: software identifikuje a kvantifikuje kontaminující nukleové kyseliny (RNA v dsDNA, dsDNA v RNA) a poskytuje „corrected concentration“; v testech se korigované koncentrace pohybovaly většinou v ±10–20 % vůči teoretické hodnotě.
• Real‑time release & final product testing (DXR3 SmartRaman): demonstrační studie ukázala, že diskriminační analýza Ramanových spekter umožňuje rychlé rozlišení 15 typů hotových biopreparátů i kvantifikaci konzervantů pomocí PLS s vysokým R² (≈0.998–0.999) a nízkými RMSEP hodnotami; metoda minimalizuje nároky na send‑out testy.
• Procesní Raman pro downstream pufry a UF/DF: MarqMetrix All‑In‑One + FlowCell dokázal v reálném čase kvantifikovat L‑histidin, L‑arginin a sacharózu během UF/DF s chybou <5 %. Navíc systém detekoval rozklad sacharózy na glukózu/fruktózu (pH/osmolarita se změnily), Q‑residua umožnila vyhodnotit kvalitu pufru a odhalit nekontrolované změny.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá, neinvazivní a reagent‑free analýza s nízkou spotřebou vzorku; vhodné pro at‑line/in‑line PAT systémy a automatizaci rozhodnutí (např. automatické dávkování glukózy, řízení diafiltrace).
• Umožnění real‑time release strategií: monitoring kritických parametrů a atributů během výroby může snížit potřebu rozsáhlých offline testů a zrychlit uvolnění šarží.
• Zvýšení reproducibility a snížení lidských chyb díky automatizovaným analytickým okruhům a nasazeným chemometrickým modelům.
• Úspora času a nákladů: méně send‑out testů, menší potřeba rozpouštědel a analytických kolon, rychlejší rozhodnutí v procesu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšířené nasazení PAT: širší integrace Raman/NIR/FTIR do automatizovaných řídicích smyček (closed‑loop control) pro upstream i downstream kroky.
• Zlepšená přenositelnost modelů: standardizační a korekční algoritmy, harmonizace instrumentálních odpovědí (SRM, normalizace), a robustní multivariátní adaptivní učení pro mezipřístrojové nasazení.
• Využití strojového učení a pokročilých validací pro multi‑attribute testing (MAT) a prediktivní údržbu modelů; model‑management a kontinuální rekalibrace v regulačním rámci QbD/RTRT.
• Multiparametrické senzory a multimodální fúze dat (spektrální + online fyzikální měření: pH, osmolarita, průtok) pro lepší diagnostiku stability pufrů a detekci biologických kontaminací.
• Regulační akceptace: rostoucí zájem regulačních orgánů o osvědčené PAT strategie povede k širšímu uznání spektroskopie jako prostředku k real‑time release.

Závěr

Kompendium ukazuje, že kombinace vibrationalních technik (FTIR, NIR, Raman) a UV‑Vis spektrometrie představuje silný analytický stack pro biopharmaceutickou výrobu. Příklady ilustrují, že spektroskopie podporuje identifikaci surovin, kvantifikaci cílových proteinů v živých kulturách, kontrolu agregací, automatizaci procesů (např. glukózové dávkování), a real‑time monitoring downstream kroků (UF/DF). Klíčové výzvy zůstávají v oblasti přenositelnosti a udržování chemometrických modelů, v harmonizaci instrumentálních rozdílů a v integraci do regulovaných procesů. Nicméně technologický i softwarový vývoj (standardizace, integrované PAT platformy, akceptace RTRT) umožňuje rozšíření praktického využití těchto metod v průmyslové praxi.

Reference

1. Elliott A., Ambrose E.J. Structure of synthetic polypeptides. Nature 1950;165:921–922.
2. Jackson M., Mantsch H.H. The use and misuse of FTIR spectroscopy in the determination of protein structure. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 1995;30:95–120.
3. Barth A. Infrared spectroscopy of proteins. Biochim. Biophys. Acta 2007;1767:1073–1101.
4. Byler D.M., Susi H. Examination of the secondary structure of proteins by deconvolved FTIR spectra. Biopolymers 1986;25:469–487.
5. Surewicz W.K., Mantsch H.H. New insight into protein secondary structure from resolution‑enhanced infrared spectra. Biochim. Biophys. Acta 1988;952:115–130.
6. Villa J., Zustiak M. et al. Use of Lykos and TruBio Software Programs for Automated Feedback Control to Monitor and Maintain Glucose Concentrations in Real Time (aplikace MarqMetrix).
7. Yang J‑D. et al. Fed‑Batch Bioreactor Process Scale‑up for Monoclonal Antibody Production. Biotechnol. Bioeng. 2007;98(1):141–154.
8. Workman J. A Review of Calibration Transfer Practices and Instrument Differences in Spectroscopy. Appl. Spectrosc. 2018;73(3):340–365.
9. Guo S., Popp J., Bocklitz T. Chemometric analysis in Raman spectroscopy from experimental design to machine learning‑based modeling. Nat. Protoc. 2021;16:5426–5459.
10. Kalivas J.H., et al. Calibration Maintenance and Transfer using Tikhonov Regularization Approaches. Appl. Spectrosc. 2009;63(7):800–809.
11. Hawe A., Friess W., Sutter M., Jiskoot W. Analytical Biochemistry 2008;38:115–122 (protein aggregation overview).
12. Yao G., Li K.A., Tong S.Y. Rayleigh scattering correction methods, Anal. Chim. Acta 1999;398:319–327.
13. Anthis N.J., Clore G.M. Sequence‑specific determination of protein and peptide concentrations by absorbance at 205 nm. Protein Sci. 2013;22:851–858.
14. Oldenburg S.J., Averitt R.D., Westcott S.L., Halas N.J. Nanoengineering of optical resonances. Chem. Phys. Lett. 1998;288:243–247.
15. Kapadia C.H., Melamed J.R., Day E.S. Quantification of gold nanoparticles/nanoshells using NanoDrop One microvolume UV‑Vis Spectrophotometer (technické aplikace).
16. Choquette S.J. et al. Relative Intensity Correction of Raman Spectrometers: NIST SRMs. Appl. Spectrosc. 2007;61(2):117–129.
17. Agrawal P. et al. A Review of Tangential Flow Filtration: Process Development and Applications in the Pharmaceutical Industry. Org. Process Res. Dev. 2023;27(4):571–591.