Enhancing Monoclonal Antibody Yield and Quality Through Automated Multi-Component Feedback Control Loops Using the MarqMetrix All-In-One Process Raman Analyzer

Význam tématu

V reálném čase monitorovat více klíčových parametrů v bioreaktorech je zásadní pro zajištění konzistentní produkce monoklonálních protilátek s vysokým výtěžkem a kvalitními atributy. Moderní PAT (Process Analytical Technology) nástroje, jako je in-line Raman spektroskopie, umožňují nelineární, vícekomponentní sledování živin, metabolitů a hustoty buněk a tím podporují automatizované, adaptivní strategie dokrmování a řízení metabolismu buněk. To vede ke snížení variability, lepší kvalitě produktu (méně nežádoucích modifikací) a vyšším ziskům z výroby.

Cíle a přehled studie

Studie zkoumala nasazení procesu Ramanového analyzátoru Thermo Scientific MarqMetrix All‑In‑One pro simultánní, automatické řízení glukózy a laktátu v pěti litrovém bioreaktoru s CHO‑K1 GS buňkami. Hlavním cílem bylo udržet celkový zdroj uhlíku (glukóza + laktát) na cílové hladině 2 g/L pomocí zpětnovazebního řízení a porovnat tuto strategii s dvěma kontrolními režimy: konstantní kontinuální řízenou glukózou (8 g/L) a konvenčním bolusovým krmením udržujícím 3–6 g/L. Hodnoceny byly titer, kvalita produktu (glykace/glykozylace), životaschopnost buněk a robustnost chemometrických modelů.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• Buňky a kultivace: CHO‑K1 GS v Efficient‑Pro médiu; bioreaktor 5 L; teplota 37 °C; pH 7 ± 0,2; DO 40 %; perioda běhu 14 dnů; krmení od dne 3 buď bolusově nebo kontinuálně.
• Řídicí logiky: (1) kontinuální glukóza cíleně 8 g/L; (2) standardní bolusové krmení při poklesu pod 3 g/L až na 6 g/L; (3) celkový zdroj uhlíku (glukóza + laktát) udržovaný na 2 g/L pomocí Raman zpětné vazby.
• Integrace: výstupy modelů (glukóza, laktát) odesílány z interního PAT softwaru MarqMetrix do řídicího systému TruBio, který spouští dávkování přes DeltaV pump controller.

Instrumentace:

• Thermo Scientific MarqMetrix All‑In‑One Process Raman Analyzer.
• MarqMetrix Performance BallProbe Sampling Optic (a volitelně FlowCell Sampling Optic).
• Laser 785 nm; výkon 450 mW; integrační čas 3000 ms; průměrování 20 skenů.
• Software: interní Pythonová pipeline pro správu dat (kosmické paprsky, průměrování, časová zarovnání) a komerční chemometrický balík SOLO 9.3.1; řídicí software TruBio a DeltaV pro automatizované dávkování.

Chemometrie a modely:

• Typ modelu: PLS (Partial Least Squares) pro glukózu a laktát.
• Glukóza — vybrané spektrální regiony: 1065–1232, 1595–1863, 2704–3078 cm⁻¹; předzpracování: Savitzky‑Golay (1. derivace, pořadí 2, okno 13), SNV, mean‑centering.
• Laktát — region 800–1750 cm⁻¹; předzpracování: Savitzky‑Golay (1. derivace, okno 11), L1‑norma (normalizace plochy 1540–1750 cm⁻¹), mean‑centering.
• Validace: leave‑one‑out cross‑validation pro volbu počtu latentních proměnných; metriky modelu zahrnovaly R² v rozmezí ~0,80–0,96 a SEP přibližně 0,18–0,66 g/L v závislosti na analytu a datasetu.

Hlavní výsledky a diskuse

Klíčové nálezy:

• Udržování celkového zdroje uhlíku (glukóza + laktát) na 2 g/L vedlo k >10% nárůstu celkového titru oproti kontinuální glukóze a konvenčnímu bolusovému režimu.
• Strategie „total carbon“ výrazně snížila akumulaci laktátu během běhu tím, že omezila přidávání glukózy při zvýšených hladinách laktátu, čímž podporovala pozdní spotřebu laktátu.
• Kvalita produktu: glykace byla výrazně nižší v režimu total carbon (cca 2 %) oproti 12 % při kontinuální glukóze a 6 % při bolusovém režimu; to odpovídá zlepšení kvality o ~83 % vs. kontinuální a ~66 % vs. bolus.
• Životaschopnost buněk byla vyšší (~>15 % zlepšení podle interních hlášení) při total carbon řízení ve srovnání s jinými režimy; viabilita a VCD byly srovnatelné či lepší než u kontinuálního režimu, lepší než u standardního bolusu.
• Chemometrické modely poskytovaly robustní predikce v reálném čase vhodné pro automatické řízení; předzpracování a výběr spektrálních pásem zlepšily specifitu glukózového signálu i přes překryv se signály jiných biomolekul.

Diskuse:

Výsledky ukazují, že multi‑komponentní datový vstup umožňuje komplexnější regulační logiku než řízení jediné proměnné. Application Raman analyzátor dodává dostatečně častá a spolehlivá data (měřeno v řádu minut) pro řízení dávkování v reálném čase a minimalizaci metabolických odchylek vedoucích ke zhoršení kvality produktu.

Přínosy a praktické využití metody

• Non‑destruktivní, in‑line měření více analytů v jednom měření šetří čas i materiál a eliminuje zpoždění spojené s off‑line testováním.
• Schopnost přímé integrace do automatizovaných řídicích systémů (TruBio, DeltaV) umožňuje plně automatizované krmení a snížení manuálních zásahů.
• Zlepšení titru a snížení nechtěných modifikací (např. glykace) mají přímý ekonomický dopad — větší čistý výtěžek a méně náročné následné čištění a kontrolu kvality.
• Flexibilita hardwaru (vyměnitelné sondy, kompaktní provedení) podporuje nasazení v různých objemech a pracovních postupech.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření multi‑analyzového řízení: zavedení dalších metabolitů (aminokyseliny, organické kyseliny) pro komplexnější metabolické mapování a řízení.
• Škálovatelnost a přenositelnost modelů: další práce směřují k ověření přenositelnosti modelů mezi buňkovými liniemi, médii a různými měřítky procesu.
• Integrace s AI a prediktivní údržbou: datově bohaté Sirius/Raman platformy umožní nasazení pokročilých algoritmů pro predikci odchylek a autonomní rozhodování.
• Regulační a kvalifikační aspekty: standardizace postupů validace chemometrie a integrace PAT do GMP prostředí bude klíčová pro širší průmyslové přijetí.

Závěr

Studie demonstrovala, že MarqMetrix All‑In‑One Process Raman Analyzer umožňuje spolehlivé, vícekomponentní řízení živin a metabolitů v bioreaktoru v reálném čase. Řízení celkového zdroje uhlíku (glukóza + laktát) přineslo významné zlepšení titru, kvality monoklonální protilátky a životaschopnosti buněk. Platforma se ukazuje jako praktické a škálovatelné PAT řešení vhodné pro moderní automatizované a datově řízené výrobní procesy v biotechnologii.

Reference

1. Abu‑Absi NR, Kenty BM, Cuellar ME, et al. Real Time Monitoring of Multiple Parameters in Mammalian Cell Culture Bioreactors Using an In‑Line Raman Spectroscopy Probe. Biotechnology and Bioengineering. 2011;108(5):1215–1221. DOI: 10.1002/bit.23023.
2. Zhou M, Crawford Y, Ng D, et al. Decreasing Lactate Level and Increasing Antibody Production in Chinese Hamster Ovary Cells (CHO) by Reducing the Expression of Lactate Dehydrogenase and Pyruvate Dehydrogenase Kinases. Journal of Biotechnology. 2011;153(1):27–34. DOI: 10.1016/j.jbiotec.2011.03.003.
3. Villa J, Khadka N, Keck K, Zhang L, Zustiak M. Process Raman as Platform Solution For Automated Glucose Feeding in Fed‑Batch Bioreactors. (Application note/internal report).
4. Villa J, Zustiak M, Ramirez D, et al. Demonstrating Chemometric Model Transferability for 5 Mammalian Cell Lines and 5 Media Types Using the Thermo Scientific MarqMetrix All‑In‑One Process Raman Analyzer to Monitor Upstream Bioprocesses. (Application note/internal report).
5. Villa J, Zustiak M, Kuntz D, et al. Use of Lykos and TruBio Software Programs for Automated Feedback Control to Monitor and Maintain Glucose Concentrations in Real Time. (Application note/internal report).