Process Raman as a comprehensive solution for downstream buffer workflow

Význam tématu

Procesní Ramanova spektroskopie se prosazuje jako klíčová PAT (Process Analytical Technology) metoda pro monitorování a řízení downstream procesů v biotechnologii. Umožňuje neinvazivní, rychlé a molekulárně specifické měření v kapalných fázích bez nutnosti přípravy vzorku, což je výhodné pro řízení dynamických operací jako jsou ultrafiltrace a diafiltrace (UF/DF). Schopnost současně sledovat několik excipientů a proteinu v reálném čase zvyšuje jistotu výsledku, zkracuje rozhodovací čas a otevírá cestu k automatizaci procesů.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat použití Thermo Scientific MarqMetrix All‑In‑One Process Raman Analyzer pro kvantifikaci běžných excipientů (L‑histidin, L‑arginin, sacharóza) během bench‑scale UF/DF procesu IgG1 monoklonální protilátky. Dále autoři ověřili schopnost Ramanovy metody rozpoznat a varovat před zhoršením kvality předpřipravených bufferů (př. hydrolýza sacharózy) a diskutovali přínosy pro řízení a automatizaci downstream operací.

Použitá metodika a instrumentace

• Analytické přístroje: Thermo Scientific MarqMetrix All‑In‑One Process Raman Analyzer s FlowCell Sampling Optic a BallProbe Sampling Optic.
• Kalibrace a modelování: PLS (Partial Least Squares) modely pro L‑histidin (0–15 mg/mL), L‑arginin (0–40 mg/mL) a sacharózu (0–200 mg/mL). Do tréninkové množiny byly přidány spektra IgG1 v rozsahu 5–150 mg/mL pro zvýšení robustnosti vůči proteinovým maticím.
• Spektroskopické podmínky: spektrální rozsah 800–3235 cm⁻¹, normalizace na infinity norm v oblasti 2900–3230 cm⁻¹, předzpracování Savitzky‑Golay (1. derivace, polynom řádu 2, okno 13), střednění průměru; výběr latentních proměnných pomocí leave‑one‑out křížové validace (LOOCV).
• Akvizice: laser 450 mW, integrační doba 3000 ms, průměr 3 spekter → ~18 s na výsledné měření; průtok vzorků skrz FlowCell 100 mL/min.
• UF/DF procesní parametry (bench‑scale): PES membrána, vyrovnání membrány v Tris pH 7.0; podání IgG1 při 10 g/L do cílového naložení 500 g/m²; první UF: průtok 300 L/m²·h, TMP 10–15 psi; diafiltrace prováděná manuálním přidáváním DF bufferu při udržování objemu; následné druhé UF pro dosažení konečné koncentrace.

Hlavní výsledky a diskuse

• Modely pro histidin, arginin a sacharózu prokázaly dobrou předpovědní schopnost: validační testy na 7 nezávislých vzorcích na 3 různých přístrojích vykázaly vysoké koeficienty determinace (R² > 0.98 pro predikci) a nízké RMSE, s absolutními chybami predikce menšími než ~5 % vůči HPLC referencím.
• Aplikace modelů in‑line během UF/DF ukázala, že Raman dokáže sledovat průběh diafiltrace a detekovat odchylky od očekávaného chování excipientů (např. pokles sacharózy v retentátu během UF2), což bylo potvrzeno offline HPLC analýzou.
• Případ zhoršení kvality bufferu: Raman v reálném čase identifikoval neočekávané snížení koncentrace sacharózy během 15denního držení vzorku. Spektrální analýza odhalila vznik signálů glukózy a fruktózy a HPLC potvrdilo hydrolýzu sacharózy. Souběžně pozorovali nárůst osmolality a pokles pH o přibližně 1 jednotku, což naznačuje kyselou hydrolýzu jako příčinu.
• Statistické monitorování: autoři využili Q‑rezidua a redukovanou Hotellingovu T² pro hodnocení kvality bufferu. Nárůst Q‑rezidua při postupu hydrolýzy poskytl signalizaci selhání kontroly kvality dříve, než by tomu bylo jen na základě teoretických odhadů.
• Omezení modelu: původní PLS model sacharózy nebyl trénován na spektrech glukózy a fruktózy, což vedlo k částečným odchylkám v kvantifikaci (pře‑/podhodnocení). Doplnění tréninkové množiny o tyto produkty by zlepšilo přesnost a robustnost modelu.

Přínosy a praktické využití metody

• Reálné časové kvantifikace excipientů s chybou <5 % nahrazují potřebu častých offline HPLC měření, čímž se zkracuje doba rozhodování a snižují náklady na analýzy.
• Možnost simultánního sledování proteinu a více excipientů v jednom měření umožňuje přesnější vedení diafiltrace a eliminuje spoléhání se na teoretické předpoklady (např. předpoklad retenčního faktoru R = 0), čímž se redukuje riziko neúplné výměny bufferu vlivem jevů jako Gibbs‑Donnan.
• Včasné odhalení změn kvality bufferu (hydrolýza, kontaminace, pH posun) přispívá k prevenci znehodnocení šarží a lepšímu řízení surovin před použitím v kritických procesech.
• Data vhodná pro zpětnou vazbu a řízení procesu — otvírá cestu k automatizaci UF/DF na základě skutečných koncentrací místo empirických modelů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření kalibračních sad o běžné produkty degradačních reakcí (např. glukóza, fruktóza) a potenciální kontaminanty pro zvýšení robustnosti a schopnosti detekce širší škály procesních událostí.
• Integrace Raman dat do automatizovaných řídicích smyček (real‑time feedback control) pro dynamické řízení diavolumů, průtoků a TMP s cílem optimalizovat výtěžnost a kvalitu.
• Využití vícelokálního snímání (FlowCell + BallProbe) a model‑transfer mezi přístroji pro škálovatelnost metodiky z bench‑scale na pilotní a výrobní stupně.
• Vývoj statistických kontrolních limitů a validačních postupů (T² vs Q) jako součást provozních SOP pro průběžné sledování kvality bufferů a procesních toků.

Závěr

Procesní Ramanova spektroskopie, aplikovaná přes MarqMetrix All‑In‑One Analyzer s FlowCell/ BallProbe, poskytuje spolehlivé, rychlé a multi‑analyzové monitorování excipientů a proteinů během UF/DF. Studie dokládá přesnosti modelů (absolutní chyba <5 %), přínos včasné detekce zhoršení bufferů a potenciál pro řízení a automatizaci downstream operací. Doporučeným dalším krokem je rozšíření tréninkových dat a zavedení Raman‑řízených kontrolních strategií v průmyslovém měřítku.

Reference

• Zhang L.; Liang Y.-Z.; Jiang J.-H.; Yu R.-Q.; Fang K.-T. Uniform Design Applied to Nonlinear Multivariate Calibration by ANN. Analytica Chimica Acta 1998, 370(1), 65–77.
• Choquette S. J.; Etz E. S.; Hurst W. S.; Blackburn D. H.; Leigh S. D. Relative Intensity Correction of Raman Spectrometers: NIST SRMs 2241–2243. Applied Spectroscopy 2007, 61(2), 117–129.
• Torres A. P.; Oliveira F. a. r.; Silva C. l. m.; Fortuna S. p. The Influence of pH on the Kinetics of Acid Hydrolysis of Sucrose. Journal of Food Process Engineering 1994, 17(2), 191–208.
• Wiercigroch E.; Szafraniec E.; Czamara K.; et al. Raman and Infrared Spectroscopy of Carbohydrates: A Review. Spectrochimica Acta Part A 2017, 185, 317–335.
• Kumar S.; Martin E. B.; Morris J. Detection of Process Model Change in PLS Based Performance Monitoring. IFAC Proceedings Volumes 2002, 35(1), 125–130.
• Agrawal P.; Wilkstein K.; Guinn E.; et al. A Review of Tangential Flow Filtration: Process Development and Applications in the Pharmaceutical Industry. Organic Process Research & Development 2023, 27(4), 571–591.
• Nolasco M.; Pleitt K.; Khadka N. Using a Process Raman Analyzer as an In‑Line Tool for Accurate Protein Quantification in Downstream Processes.
• Nolasco M.; Pleitt K.; Khadka N. Raman‑Based Accurate Protein Quantification in a Matrix That Interferes with UV‑Vis Measurement.