Determination of 366 Pesticides in Cocoa Liquor

Význam tématu

Analýza reziduí pesticidů v kakaové hmotě je kritická pro bezpečnost potravin, soulad s regulačními limity a posouzení kvality surovin pro výrobu čokolády. Kakaová hmota je extrémně náročné analytické matrice kvůli vysokému obsahu lipidů, přírodních pigmentů a dalších spolusložek, které zhoršují přesnost kvantifikace, způsobují matrix efekty a kontaminaci detektoru. Robustní, citlivé a selektivní vícestopé metody s účinným čištěním jsou proto nezbytné pro spolehlivé monitorování stovek pesticidů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem bylo vyvinout a ověřit univerzální workflow pro simultánní stanovení 366 pesticidů v kakaové hmotě kombinací GC/MS/MS a LC/MS/MS. Metoda zahrnuje extrakci podle QuEChERS AOAC, passtrough čištění pomocí Agilent Captiva EMR-GPD a následnou analýzu na platformách Agilent 8890/7010D (GC/MS/MS) a 1290 Infinity III/6475 (LC/MS/MS). Studie usilovala o vysokou krytí analytů, dobrou přesnost, opakovatelnost a provozní robustnost v náročné matici.

Použitá metodika

Postup vzorkování a přípravy:

• Vzorek: 1,5 g kakaové hmoty.
• Hydratace 4 mL vody s 0,1 % kyselinou mravenčí, promíchání.
• Extrahování 15 mL acetonitrilu s 1 % kyselinou octovou podle QuEChERS AOAC (Agilent Bond Elut).
• Přidání solí z AOAC packetu a keramických homogenizérů, třesení na Geno/Grinder 1 500 rpm po dobu 5 min, odstředění 5 000 rpm 5 min.
• Přenos 2,7 mL extraktu smíchaného s 0,3 mL vody (3 mL) do Captiva EMR-GPD passtrough cartridge; eluce gravitačně nebo při nízkém tlaku, následné vysušení sorbentu a sušení eluátu anhydr. MgSO4 (~200 mg), odstředění.
• Aliquot supernatantu: přímý pro GC/MS/MS; 5× naředěný pro LC/MS/MS.

Čištění: Captiva EMR-GPD obsahuje kombinaci selektivních sorbentů (Carbon S pro pigmenty, PSA pro mastné kyseliny, EC‑C18 pro hydrofobní složky) optimalizovaných pro redukci matricových interferencí v kakaové hmotě.

Použitá instrumentace

Hlavní analytické přístroje a preparativní vybavení uvedené ve studii:

• GC systém: Agilent 8890 GC s kolonkou HP-5Q (30 m × 0,25 mm, 0,25 µm).
• GC/MS/MS: Agilent 7010D triple quadrupole, dMRM režim.
• LC systém: Agilent 1290 Infinity III UHPLC s kolonkou ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 (2.1 × 150 mm, 1.8 µm).
• LC/MS/MS: Agilent 6475 triple quadrupole, dMRM režim.
• Pomocné vybavení: Agilent Bond Elut QuEChERS AOAC kit, Captiva EMR‑GPD 6 mL cartrdiges, PPM-48 pozitivní tlakový manifold, Geno/Grinder, vícestopé vortexery a centrifugy (Eppendorf).

Parametry měření (vybrané):

• GC: inj. 1 µL split 5:1, konstantní tok He ~1,2 mL/min, program pece 60 °C → 170 °C → 310 °C.
• LC: mobilní fáze A = 5 mM amonný formiát + 0,1 % kys. mravenčí (voda), B = 5 mM amonný formiát + 0,1 % kys. mravenčí (methanol), průtok 0,4 mL/min, inj. 2 µL.
• Oba MS systémy: dMRM režim pro zvýšení selektivity a cyklového využití instr. času; použití Agilent MRM databází pro optimalizaci přechodů.

Hlavní výsledky a diskuse

Rozsah pokrytí:

• GC/MS/MS: 76 analytů (z toho 18 analyzovatelných i LC/MS/MS).
• LC/MS/MS: 308 analytů.
• Celkem 366 unikátních pesticidů.

Výkonnost metody:

• Lineární rozsahy (matrix‑matched): GC 2,5–100 ng/mL; LC 0,5–50 ng/mL. Pro většinu analytů splněno R2 ≥ 0,99.
• Přesnost: >92 % analytů vykázalo recovery mezi 70–120 % po QuEChERS + EMR‑GPD čištění.
• Opakovatelnost: RSD < 20 % pro všechny analyty při šesti replikách.
• Srovnání technik: u 18 společných analytů byly recovery a RSD srovnatelné mezi GC a LC; některé látky vykazovaly lepší citlivost na jedné z technik (příklad: triazophos citlivější na LC, chlorpyrifos citlivější na GC).

Diskuse o matici a čištění:

• Captiva EMR‑GPD významně redukovala pigmenty, lipidy a hydrofobní interferenty, což vedlo k menším matrix efektům, delší době mezi údržbami přístrojů a stabilnějších měřeních.
• Přístup „passthrough“ umožnil jednoduchou a rychlou manipulaci bez potřeby intenzivního manipulačního kroku, což je výhodné pro rutinní vysokopropustové laboratoře.
• Použití databází dMRM přechodů (Agilent P&EP a aplikační metody) usnadnilo výběr optimalizovaných přechodů pro danou matrici a zrychlilo vývoj metody.

Přínosy a praktické využití metody

Praktické přínosy implementace tohoto workflow:

• Komplexní pokrytí širokého spektra pesticidů umožňuje jedním pracovním postupem splnit regulační požadavky a potřeby monitorování bezpečnosti potravin v kakaových produktech.
• Účinné odstranění maticových interferencí snižuje četnost údržby hmotnostních spektrometrů a zvyšuje provozní dobu mezi servisními zásahy.
• Metoda je kompatibilní s běžnými rutinními platformami a vybavením v analytických laboratořích, což usnadňuje přenositelnost a validaci v QA/QC provozech.
• Přímá passtrough filtrace zjednodušuje workflow a zkracuje čas přípravy vzorků, což je výhodné pro vysoký počet vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Možné směry dalšího rozvoje a uplatnění:

• Rozšíření pokrytí o metabolity a nově vznikající nebezpečné látky včetně nestandardních pesticidních degradátů.
• Integrace s vysoce rozlišovacími technikami (HRMS) pro neselektivní screening a identifikaci neočekávaných compoundů.
• Automatizace přípravy vzorků a passtrough čištění pro vyšší propustnost a konzistenci.
• Optimalizace použití interních standardů a isotopně značených standardů pro further snížení vlivu matrice a zlepšení spolehlivosti kvantifikace.
• Zelenější přístupy: minimalizace spotřeby organických rozpouštědel a využití udržitelných sorbentů.
• Pokročilé softwarové nástroje a AI pro automatickou kontrolu kvality dat, korekci matrix efektů a rychlejší vyhodnocení komplexních výsledků.

Závěr

Autoři prokázali robustní, citlivý a přenosný workflow pro stanovení 366 pesticidů v kakaové hmotě kombinací QuEChERS AOAC extrakce, Captiva EMR‑GPD passtrough čištění a cílené analýzy na GC/MS/MS a LC/MS/MS v dMRM režimu. Metoda dosáhla vynikajících hodnot linearity, přesnosti (recoveries 70–120 % pro >92 % analytů) a opakovatelnosti (RSD < 20 %). Implementace tohoto postupu usnadňuje regulativní monitorování, zvyšuje provozní robustnost a je vhodná pro rutinní kontrolní laboratoře zabývající se bezpečností kakaových produktů.

Reference

1. Chaudhary V, Mongia G, Drake M. Approaches to Determine the Flavor and Flavor Chemistry of Cocoa Beans and Cocoa Liquor. Food Science. (publikace dostupná online).
2. European Commission. SANTE/11312/2021: Analytical Quality Control and Method Validation Procedures for Pesticide Residues Analysis in Food and Feed. Pracovní dokument pro MRL a validaci analytických postupů.
3. Agilent Technologies. The Agilent MassHunter Pesticide and Environmental Pollutants (P&EP) MRM Database, G9250AA, verze P&EP 4.0.
4. Zou A, et al. Comprehensive LC/MS/MS Workflow of Pesticide Residues in Food Using the Agilent 6470 Triple Quadrupole LC/MS. Agilent Technologies application note, publ. no. 5994-2370EN, 2020.