Analysis of Bile Acid by GC-MS

Význam tématu

Bile kyseliny hrají klíčovou roli v trávení tuků a jsou důležitými biomarkery pro stav střevní mikrobioty. Spolehlivá kvantifikace jednotlivých složek směsi s vysokou specifičností a citlivostí je proto zásadní pro biochemický výzkum, klinické studie i průmyslové aplikace.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem publikovaného protokolu bylo zavést robustní metodu GC-MS pro kvantitativní analýzu 22 typů bile kyselin. Studie demonstruje postup derivatizace i chromatograficko-hmotnostní parametry, ukazuje rozsah kvantifikace, linearitu, reprodukovatelnost a stabilitu vzorků.

Použitá metodika a instrumentace

Metoda zahrnuje dva kroky chemické derivatizace:

• Methylace karboxylové skupiny pomocí diazomethanu (TMS-N₂) v benzenu s následnou odplyněním dusíkem.
• Trimethylsilylace hydroxylových skupin přidáním pyridinu, trimethylchlorosilanu (TMCS) a N-trimethylsilylimidazolu (TMSI) při 60 °C po dobu 10 minut.

Chromatograficko-hmotnostní analýza:

• Přístroj: GCMS-QP™2020 NX (Shimadzu)
• Kolona: DB-5MS, 30 m × 0,25 mm, film 0,25 µm
• Režim injekce: splitless, teplota vaporizéru 310 °C
• Program teploty kolony: 230 °C držení 2 min → 8 °C/min do 310 °C držení 5 min
• Režim MS: scan m/z 35–700 nebo SIM, ionizační zdroj 200 °C, interface 280 °C

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda poskytla:

• Široký dynamický rozsah 0,1–500 ng pro různé bile kyseliny.
• Vysokou linearitu kalibračních křivek (R2 ≥ 0,995) pro všech 22 analyzovaných sloučenin.
• Dobrou reprodukovatelnost (RSD n=3 mezi 0,7–12,4 %) na nejnižší hladině rozsahu.
• Stabilitu derivatizovaných vzorků po 20 h (relativní plochy 70–120 %) a částečnou zachování po 38 h.

Diskuse zdůrazňuje spolehlivost rozlišení strukturálně podobných molekul GC-MS ve srovnání s LC-MS/MS, zejména v režimu SIM s vnitřním standardem (cholová kyselina-d5).

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutá metoda umožňuje:

• Precizní kvantifikaci širokého spektra bile kyselin v biologických vzorcích.
• Využití v klinických studiích pro sledování metabolismu tuků a diagnostiku jaterních či střevních onemocnění.
• Podporu farmaceutického vývoje a sledování účinnosti probiotik či terapeutik zaměřených na střevní mikrobiotu.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Automatizace předúprav vzorků pro vyšší průtok laboratoří.
• Integrace s vysokorozlišovacími hmotnostními spektrometry pro neznámé metabolity.
• Kombinované metody GC×GC-MS pro komplexní metabolomické studie.
• Širší aplikace v environmentálních a potravinářských analýzách.

Závěr

Popsaná GC-MS metoda s dvojitou derivatizací poskytuje robustní, citlivý a reprodukovatelný postup pro široké spektrum bile kyselin. Díky vysoké specificitě a linearitě je vhodná pro výzkum, klinické i průmyslové aplikace.

Reference

Shimadzu Corporation. Analysis of Bile Acid by GC-MS, Application News No. M283 (LAAN-A-MS-E047), First Edition November 2019.