Metabolomics of Opiate-Induced Changes in Murine Brain by GC/Q-TOF

Význam tématu

Metabolomika poskytuje přímé informace o biochemickém stavu organismu a umožňuje identifikovat metabolické dráhy ovlivněné léčivy. V případě opiátů se metabolomické změny v mozkové tkáni mohou podílet na mechanismech závislosti, bolesti a tolerance. Studium rozdílů mezi myšími kmeny s různou citlivostí na morfin může odhalit biomarkery a cíle pro terapeutické zásahy.

Cíle a přehled studie

Cílem popsané práce bylo použití netargetovaného GC/Q-TOF metabolomického přístupu k porovnání změn v mozkových metabolitech dvou kmenů myší (morfin-citlivý C57BL/6 a morfin-rezistentní 129Sv1) po aplikaci morfinu. Studie usilovala o identifikaci klíčových sloučenin, jejichž hladina se statisticky významně liší mezi ošetřenými a kontrolními skupinami a mezi kmeny.

Použitá metodika a instrumentace

Metabolity extrahované z mozkového kmene metodou Folch byly derivatizovány pomocí methoximace a silylace (MSTFA + TMCS). Analýza proběhla na GC 7890B spojené s Q-TOF 7200 (EI a PCI režimy). Data se zpracovávala dekonvolucí špiček v MassHunter Qualitative, identifikací ve Fiehn RTL a NIST knihovnách, potvrzením vzorců pomocí FFA/MFG a strukturálním ověřením v Molecular Structure Correlator. Statistické vyhodnocení (PCA, Volcano ploty) a filtraci významných změn zabezpečilo Agilent Mass Profiler Professional.

Použitá instrumentace

• Agilent 7890B GC
• Agilent 7200 GC/Q-TOF MS
• MassHunter Qualitative Analysis, Mass Profiler Professional, Molecular Structure Correlator

Hlavní výsledky a diskuse

Pomocí PCA byly zřejmé odlišné klastrování kontrolních a morfinem ošetřených skupin u obou kmenů a také interkmenové rozdíly.
Adenosin se výrazně snížil pouze u morfinem ošetřených citlivých myší (p<0,05). U srovnání kmenů bez morfinu bylo nalezeno 21 metabolitů s významnými rozdíly, včetně adenosinu 5’-monofosfátu, glycerové kyseliny, cholesterolu a neurotransmiteru N-acetylaspartylglutamátu.
U neznámé špičky byla pomocí EI a PCI MS/MS určena empirická formule, chemické addukty v PCI potvrdily molekulární ion a MSC v ChemSpider poskytl strukturu α-hydroxiglutarové kyseliny, která akumulovala v rezistentním kmenu.

Přínosy a praktické využití metody

Popisovaný workflow kombinuje citlivé měření ve full scanu, přesnou hmotnost, MS/MS selektivitu a pokročilou datovou analýzu. Umožňuje odhalit slabě zastoupené metabolity a potvrdit jejich identitu bez dodatečných standardů. Metoda je použitelná v neurofarmakologii, toxikologii i farmakogenomice.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace LC/MS a GC/MS pro širší pokrytí polarních i nepolárních metabolitů.
• Rozšíření databází s RT locked knihovnami a hlubší využití AI pro strukturu sloučenin.
• Kombinace metabolomiky s transkriptomikou a proteomikou pro komplexní pohled na biologické účinky léčiv.

Závěr

Netargetovaná GC/Q-TOF metabolomika prokázala citlivost a specifitu při odhalování metabolických změn vyvolaných morfinem a mezi geneticky odlišnými kmeny myší. Workflow potvrzuje vysokou hodnotu kombinace přesné hmotnosti, MS/MS a pokročilého softwaru pro odhalení nových biologických markerů.

Reference

• Folch J., Lees M., Sloane Stanley G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J Biol Chem. 226, 497–509 (1957).
• Liang D., Liao G., Wang J., Usuka J., Guo Y.Y., Peltz G., Clark J.D. A genetic analysis of opioid-induced hyperalgesia in mice. Anesthesiology. 104, 1054–1062 (2006a).