In-time TMS derivatization and GC/MS determination of Sugars, Organic Acids and Amino Acids for High Throughput Metabolomics Studies

Význam tématu

Metabolomika identifikuje změny endogenních metabolitů v biologických systémech jako odezvu na vnitřní i vnější faktory. GC–MS je pro tyto studie preferované díky vysoké separační účinnosti, robustnosti a dostupnosti rozsáhlých autentických metabolických knihoven. Derivatizace, nutná pro analýzu polárních sloučenin, bývá často časově náročným a variabilním krokem, což omezuje průchodnost a reprodukovatelnost při větších sériích vzorků.

Cíle a přehled studie / článku

Autoři představují automatizovaný protokol „in-time“ derivatizace pro vysokoprůchodovou GC–MS metabolomiku. Využívají GERSTEL MultiPurpose Sampler (MPS) s automatickou výměnou nástrojů a Agilent 5977 GC–MS, aby zajistili konzistentní a časově definované derivatizace jednotlivých vzorků v sérii.

Použitá metodika a instrumentace

Protokol se skládá ze dvou kroků: methoximace (MOX) a silylace (BSTFA). Vzorky v 2mL vialkách jsou uchovávány na Peltierově chladicím stacku, BFS probíhá na agitátoru. Robotické pracoviště zahrnuje GERSTEL MPS Pro s USM moduly (10 µl, 100 µl stříkačky), Fast Wash modul a Peltier Stack. Analytika se provádí na Agilent 7890B/5977B GC–MS se dvěma 15 m DB-5MS UI kolónami v 1:10 split režimu.

Hlavní výsledky a diskuse

Implementace in-time derivatizace vedla ke značnému zlepšení reproducibility. Relativní standardní odchylky (RSD) u klíčových metabolitů poklesly z 20–30 % (offline protokol) na 3–9 % (automatizace). Kvantifikace při 250 ppb prokázala vyšší návratnost a konzistentní výsledky v delších sekvencích. Časová náročnost laboratorních operací se zkrátila z hodin na desítky minut, zatímco analýza GC–MS zůstala na úrovni standardního běhu.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizovaná in-time derivatizace zvyšuje průchodnost až na stovky vzorků, minimalizuje degradaci polárních metabolitů a chyby při přenosu objemu. Snižuje opotřebení sept a spotřebu reagencií. Metoda je vhodná pro klinické, výživové i environmentální metabolomické studie vyžadující vysokou reprodukovatelnost.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další rozšíření zahrnuje zpracování 200–300 vzorků díky vícepatrovému Peltier Stacku. Integrace mikrovlnného ohřevu či řízení harmonogramu vzorků umělou inteligencí může dále zkrátit reakční časy, zvýšit spolehlivost a optimalizovat využití kapacity GC–MS.

Závěr

Metoda in-time derivatizace na GERSTEL MPS Pro významně zlepšuje kvalitu a reprodukovatelnost metabolomických dat, snižuje RSD, šetří čas i reagencie a umožňuje vysokoprůchodové analýzy. Je ekonomicky výhodná a snadno škálovatelná pro velké studie.

Reference

1. Beale D. et al., Metabolomics 2018;14:52.
2. Fiehn O., Curr Protoc Mol Biol 2016;114:30.4.1–30.4.32.
3. Fiehn O. et al., Metabolomics 2007;3:175–178.
4. Sandra K. et al., GERSTEL AppNote AN/2014/08 2014.
5. Sandra K. et al., GERSTEL AppNote AN/2015/01 2015.
6. Sansone S.A. et al., Nat Biotechnol 2007;25:846–848.
7. Sumner L.W. et al., Metabolomics 2007;3:211–221.