Laboratórne postupy stanovenia PCB látok - čast 3

Článok nadväzuje na predchádzajúcu časť o analytických postupoch stanovenia PCB látok v životnom prostredí (Laboratórne postupy stanovenia PCB látok - čast 1 a Laboratórne postupy stanovenia PCB látok - čast 2). V tejto časti laboratórnych postupov sa budeme venovať popisom postupov stanovenia PCB látok metódou plynovej chromatografie s vysokým rozlíšením (HRGC) v spojení s hmotnostným detektorom (HRGC-MS) a popíšeme si aj niektoré techniky úpravy vzoriek pre túto analýzu.

Uvedená metóda sa dostala do komerčnej praxe až v čase miniaturizácie počítačov, kedy výpočtová technika okrem sledovania a vyhodnocovania výstupných dát, ako to bolo pred nedávnom, bola zavedená aj do riadiaceho procesu ovládania detektora, injektora, termostatu ale aj samotného procesu analýzy od jej štartu až po jej ukončenie špeciálne vyvinutým softvérom. Na túto skoršiu dobu ešte 80. rokov si dobre pamätám. V laboratóriu podniku Chemko Strážske sme na plynový chromatograf s označením Chrom 5 vyvinutý ešte za ČSSR, (v tejto dobe ním bola vybavená väčšina laboratórií v republike) pripájali za detektor programovateľný integrátor so zapisovačom od fy Spectra Physics. Ten umožňoval okrem záznamu chromatogramu, vypísania retenčných časov a príslušných plôch, aj vyhodnocovanie nameraných dát po zadaní vhodnej kalibračnej metódy, ktoré boli uložené v pamäti integrátora.

Ešte v úvode článku sa chcem v krátkosti zmieniť o histórii, vzniku hmotnostnej spektrometrie a o jej spojení s plynovou chromatografiou. Od jej začiatkov asi pred 100 rokmi sa hmotnostná spektrometria (MS) stala prakticky všadeprítomným výskumným nástrojom. Medzi vedecké objavy patrí najmä objav izotopov, presné stanovenie atómových hmotností, charakterizácia nových prvkov, kvantitatívna analýza plynov, stabilné značenie izotopov, rýchla identifikácia stopových znečisťujúcich látok a liečiv a charakterizácia molekulárnej štruktúry.

Do obdobia tzv. „skorej hmotnostnej detekcie” už môžeme zaradiť pokusy anglického experimentálneho fyzika Josepha Johna Thomsona z univerzity Cambridge. V roku 1907 vyvinul zariadenie, ktoré vytváralo elektrický oblúk v nádobe, ktorá obsahovala malé množstvo plynu. V prítomnosti elektrického poľa bolo možné ióny urýchliť a manipulovať s nimi. Následne zistil, že prúd iónov plynu prechádzajúcich cez magnetické pole sa ohýba a rozdeľuje ako svetlo prechádzajúce cez polarizačný hranol. Ióny potom nasmeroval na fluorescenčnú obrazovku a spozoroval, že na miestach ich dopadu sa vytvorili jasné pruhy v závislosti od ich pomeru hmotnosti k náboju. Výsledné pruhy boli pre rôzne materiály odlišné, takže Thomson mohol identifikovať rôzne čisté materiály podľa ich jedinečných vzorov, „ich charakteristických pruhov”. Vzhľadom na tieto skutočnosti, niektorí historici pripisujú Thomsonovi titul prvého vynálezcu hmotnostnej spektrometrie, kedy sa mu v roku 1913 podarilo rozdelenie a identifikácia izotopov 20Ne a 22Ne v plyne. Iní historici však pripisujú tento vynález jeho asistentovi Francisovi Astonovi, ktorý urobil niekoľko vylepšení a v roku 1922 získal Nobelovu cenu za chémiu za vývoj prvého funkčného hmotnostného spektrografu. Pre zaujímavosť aj John Thomson získal v roku 1906 Nobelovú cenu za objav elektrónu v plyne.

Revue civilnej ochrany: Legendárny hmotnostný spektrometer v londýnskom laboratóriu v 50-tych rokoch, Model 21-101 od CEC spoločnosti; Práca na prvých hmotnostných spektrometroch

Neskorším vývojom, v polovici 20. storočia, boli vyvinuté dokonalejšie hmotnostné spektrometre, ktoré boli komerčne dostupné. Pri analýze organických látok metódou hmotnostnej spektrometrie získané ióny poskytovali hmotnostné spektrum, z ktorých bolo možné odvodiť štruktúru pôvodnej molekuly. Ak sa analyzovalo za rovnakých podmienok, každá daná zlúčenina produkovala vždy rovnaké zloženie hmotnostného spektra, čím bolo možné konštatovať, že pre každú zlúčeninu je možné prideliť jedinečné hmotnostné spektrum. Ak sú prítomné dve alebo viac zlúčenín, hmotnostné spektrum je kombináciou spektra každej zložky. Výsledok môže byť však taký „chaotický“, že sa celkom nedá použiť na identifikáciu zložiek, čo znamená, že hmotnostná spektromeria funguje dobre najmä pre čisté materiály, ale nie tak dobre pre zmesi. Toto bolo konštatované v začiatkoch vývoja hmotnostnej spektrometrie.

V 40. rokoch bol v USA dominantným komerčným prístrojom analytický hmotnostný spektrometer Model 21-101, vyrobený spoločnosťou Consolidated Engineering Corporation. Bol založený na dizajne spoločnosti Dempster a počas druhej svetovej vojny sa používal v ropnom priemysle na kvantitatívnu analýzu zmesí organických plynov. Vzhľadom k tomu, že sa budem v tomto článku ďalej zaoberať hmotnostnou spektrometriou v spojení s plynovou chromatografiou, popíšem súčasné hmotnostné detektory trochu bližšie.

Hmotnostná spektrometria (skratka MS z anglického Mass Spectrometry) je metóda analytickej chémie. Hmotnostná spektrometria pracuje s delením podľa pomeru m/Q, kde m je hmotnosť a Q je náboj fragmentu. Používa sa pre určenie hmotnosti častíc, či stanovenie elementárneho zloženia vzorky alebo molekuly a tiež pre objasnenie chemickej štruktúry molekúl, ako sú zložitejšie organické zlúčeniny a iné chemické zlúčeniny. Jej princíp je založený na ionizujúcich chemických zlúčeninách a merania ich hmotnosti vzhľadom na náboju.

Základné charakteristiky hmotnostnej detekcie:

• môže exitovať samostatne alebo v spojení so separačnými analytickými metódami,
• nemožno ju charakterizovať ako separačnú analytickú metódu,
• funguje na princípe rozdeľovanie iónov v plynnej fáze na základe pomeru m/z ( hmotnosť/náboj),
• výstupom je hmotnostné spektrum, čo je závislosť pomeru m/z od intenzity signálu, resp. relatívnej intenzity signálu (v %),
• pre jej fungovanie je potrebné zabezpečiť najprv tvorbu plynných iónov z analyzovanej vzorky vhodným spôsobom ionizácie podľa povahy vzorku,
• analýza iónov sa uskutočňuje vo vákuu.

Základné rozdelenie hmotnostných detektorov (analyzátorov)

Na základe mechanizmu delenia iónov:

• skenujúce – sektorové, kvadrupólové,
• pascové – kvadrupólová ionová pasca (QIT), iónová cyklotrónová rezonacia (ICR), orbitrap (Kingdonova pasca),
• prieletové – TOF (time-of-flight) detektor.

Na základe spôsobu urýchlenia iónov:

• kontinuálne – sektorové, kvadrupólové,
• pulzné – TOF, QIT, ICR.

Revue civilnej ochrany: Princíp fungovania hmotnostných dektorov (analyzátorov).jpg

Ešte by som v tejto časti chcel spomenúť dve dôležité analytické metódy, kde sa používa hmotnostná spektrometria, sú to:

• SIMS – metóda hmotnostnej spektrometrie sekundárnych iónov. Princípom metódy SIMS je atomárne bombardovanie povrchu primárnymi iónmi s vysokou energiou, čoho dôsledkom je emisia atómov, molekúl a klastrov z povrchu (sekundárne ióny), ktoré sú analyzované v detektore TOF.

• MALDI TOF (matrix assisted laser desorption/ionization) v kombinácii s hmotnostným detektorom doby letu (TOF). Ide o aplikáciu spektrofotometrickej metódy pro mikrobiologické laboratória na prítomnosť patogénov.

Spojenie hmotnostnej spektrometrie s plynovou chromatografiou

Opäť ešte trocha z histórie. V rokoch 1955 – 1956 vedci z americkej spoločnosti Dow Chemical, Fred McLafferty a Roland Gohlke, prvýkrát demonštrovali kombináciu plynovej chromatografie (GC) a hmotnostnej spektrometrie (MS), s cieľom identifikácie jednotlivých látok v zmesi. Toto bolo prvé spojenie separačnej technológie so spektrometrickou technikou na zabezpečenie rýchlej charakterizácie jednotlivých chemických zložiek v analyzovanej zmesi. Podľa niektorých historikov sa prvé spojenie GCMS datuje až od roku 1957, ktoré uskutočnili Holmes a Morrell zo spoločnosti Philip Morris. V roku 1964 spoločnosť Electronic Associates Inc. (EAI), vtedy popredný americký dodávateľ analógových počítačov, začal s vývojom prvého počítačom riadeného kvadrupolového hmotnostného spektrometra pod vedením Roberta Finnigana. V roku 1967 Finnigan opustil spoločnosť EAI a založil spoločnosť Finnigan Instrument Corporation. Začiatkom roku 1968 dodali prvé prototypy GC/MS s kvadrupólovým derektorom na Stanfordskú a Purdueovu univerzitu v USA. Keď spoločnosť Finnigan Instrument Corporation získala v roku 1990 spoločnosť Thermo Instrument Systems, ktorú poznáme dnes po názvom Thermo Fisher Scientific, považovala sa za popredného svetového výrobcu hmotnostných spektrometrov.

Revue civilnej ochrany: Roland Gohlke pracuje na hmotnostnom spektrometri Bendix v Dowe okolo roku 1960, vybavený je okrem priameho nástreku plynnej a kvapalnej vzorky aj temordesobciou a headspace

Prakticky až od roku 1967 sa začali vyrábať prvé komerčné GC/MS. Detektor pracujúci na báze hmotnostnej spektrometrie umožnil analyzovať každú zložku plynu vystupujúcu postupne zo separačnej kolóny plynového chromatografu. Spojenie plynovej chromatografie (GC) a hmotnostnej spektrometrie (MS) muselo na začiatku vývoja prekonať mnoho problémov. Chromatografické kolóny neboli v tejto dobe komerčne dostupné, takže sa museli vyrábať. V tomto období išlo o náplňové kolóny nerezové alebo sklenené, do ktorých sa musela doslova náplň variť. Podobné obdobie, ale s dátumom podstatne neskorším (80. roky) si aj ja dobre pamätám, kedy ako čerstvo vyštudovaný analytický chemik na Pardubickej univerzite som pripravoval v laboratóriu podniku Chemko n. p., Strážske náplňové kolóny. Chromatografická náplň do kolóny sa pripravovala tak, že sa značková polymérna chromatografická kvapalná fáza postupne zakotvovala na pevnom inertnom nosiči napr. Chromosorb, na vodnom kúpeli v sklenenej laboratórnej rotačnej vákuovej odparke. Na konci procesu prípravy sa odstraňovalo pridané rozpúšťadlo a zbytky nezakotvenej fázy. Potom sa kolóna kondicionovala v termostate chromatografu za prietoku nosného plynu, za účelom stabilizácie jej parametrov, postupným vyhrievaním tesne pod teplotu jej degradácie – tepelného rozkladu. V tomto čase ale už boli vo svete bežne dostupné hotové značkové chromatografické kolóny, avšak dostupné iba z dovozu, na čo potreboval podnik devízové prostriedky, ktorých mali výrobné podniky málo. Tie im prideľovali za prísnych podmienok príslušné podniky zahraničného obchodu. Pre chemické podniky to boli vtedy iba dva: Chemapol v Prahe a Petrimex v Bratislave.

Meno Finnigan, ktoré je spojené s vývojom hmotnostnej spektrometrie si tiež dobre pamätám v súvislosti s mojou záverečnou prácou z postgraduálneho štúdia, kedy som v roku 1988 analyzoval metódou GCMS na hmotnostnom detektore FinniganMat (iónová pasca) výrobok cyklohexaón na odbore podnikového výskumu. V tejto dobe boli takéto chromatografy novinkou a vlastnili ho iba niektoré moderné laboratória za éry ČSFR. Toľko z predchádzajúcej doby o metóde GC-MS. V súčasnosti ide o celkom rutinnú metódu analýzy, kde sa skoro výhradne používajú v GC kapilárne kolóny za nízkeho prietoku nosného plynu cca. 1 ml/min. V posledných desaťročiach nastal prudký rozmach tejto analytickej techniky. V oblasti medicíny a biológie je záujem vyvíjať metódy, ktoré sú schopné poskytovať rýchle a spoľahlivé výsledky analýz, aby bolo možné sledovať prítomnosť nebezpečných chemických látok v tele ľudí a zvierat. Najbežnejšími vzorkami v tejto oblasti sú krv, krvná plazma, krvné sérum, ale napríklad pri analýzach drog v ľudskom tele, pri určovaní príčiny úmrtia ľudí alebo zvierat sú to aj sliny, kosti, tkanivá, vlasy, srsť a podobne. Vývoj metód na stanovovanie polychlórovaných bifenylov, rezíduí organochlórovaných, organofosforových, pyretroidových pesticídov a iných polutantov, ktoré sa vyskytujú všade okolo nás, má veľký význam pre sledovanie zdravia alebo pre zisťovanie rôznych príčin chorôb. Jednou z týchto metód je aj GCMS.

Dnes je analytická metóda GC-MS základnou technikou v laboratóriách modernej analytickej chémie. Jej aplikácie zahŕňajú detekciu chemických bojových otravných látok, analýzy výbušnín, toxických organických látok v životnom prostredí, analýzy pri vývoj nových farmaceutík ale aj skríningu moču športovcov na zakázané látky zvyšujúce ich výkonnosť a využívali sa tiež pri analýze pôdnych vzoriek na Marse. Mobilné GCMS systémy, ktorými sú vybavené aj laboratória KCHL CO je možné teraz prenášať aj na jednom ramene na účely analýzy priamo v mieste mimoriadnej udalosti, čím sa dostávame bližšie ako kedykoľvek predtým k vízii sci-fi filmu Star Trek.

Revue civilnej ochrany: GCMS systém v KCHL CO v Jasove a záznam hmotnostného spektra

Principiálne pri GCMS je do hmotnostného spektrometra privádzaná vzorka v plynnom skupenstve, kde následne podlieha ionizácií a je rozdelená podľa pomeru hmotnosti a náboja iónov. Eluované plynné analyty zo separačnej kolóny sú smerované do ionizátora, kde sú ionizované.Akonáhle je vzorka ionizovaná, ona a jej ionizované fragmenty sú usporiadané zaostrovacími šošovkami, kde sú ďalej poháňané do analyzátora, roztriedené podľa m/z a počet každého vytvoreného fragmentu je vyhodnotený detektorom. Nosný plyn s analyzovanou vzorkou v plynnej fáze sa zavádzajú priamo do iónového zdroja vo vákuu, kde vákuový systém odstráni prebytočný nosný plyn. Kapilára je pred vstupom do iónového zdroja vyhrievaná, aby nedochádzalo ku kondenzácii analytu pri prechode do vákua.

Najčastejšie používané iónové zdroje môžeme rozdeliť na:

• Elektrónovú ionizáciu (EI),
• Chemickú ionizáciu (CI).

Elektrónová ionizácia (EI )

Je jednoznačne najbežnejšou a možno štandardnou formou ionizácie. Patrí medzi tvrdú ionizačnú techniku. Ide o interakciu prúdu elektrónov s energiou 70 eV so vzorkou v plynnom skupenstve. Ako zdroj elektrónov (filament) slúži rozžeravená volfrámová alebo réniová katóda. Elektróny bombardujú molekuly, čo spôsobuje jej charakteristické a reprodukovateľné fragmentovanie. Interakciou vzorky a elektrónu, vzniká tzv. radikálkatión, čo môžeme zapísať ako:

M + e⁻ → M⁺• + 2e⁻

Použitie štandardnej ionizácie 70 eV uľahčuje porovnanie vygenerovaných spektier so spektrami knižnice pomocou softvéru dodaného výrobcom alebo softvéru vyvinutého Národným ústavom pre štandardy (NIST-USA). Pri hľadaní v spektrálnej knižnici sa používajú algoritmy ich párovania, ako je napríklad: Probability Based Matching, alebo inými softvérmi vyvinutými mnohými agentúrami pre štandardizáciu metód. Uvedený typ ionizácie majú GCMS systémy v KCHL CO v Jasove a Nitre Agilent 5975T GC/MSD, kde sa identifikácia nameraných spektier vykonáva cez knižnicu NIST verziu 14, ktorá obsahuje cez 400 tisíc štandardizovaných spektier.

Pri tomto type ionizácie chcem spomenúť ešte Ionizáciu studeným elektrónom. Proces „tvrdej ionizácie“ elektrónovej ionizácie je možné zmierniť ochladením molekúl pred ich ionizáciou, čo vedie k hmotnostným spektrám, ktoré sú bohatšie na informácie V tejto metóde s názvom ionizácia za studena elektrónov (cold-EI) molekuly opúšťajú GC kolónu, zmiešajú sa s pridaným héliom a expandujú do vákua pomocou špeciálne navrhnutej nadzvukovej trysky a vytvárajú nadzvukový molekulárny lúč (SMB). Zrážky s doplnkovým plynom v rozpínajúcom sa nadzvukovom prúde znižujú vnútornú vibračnú a rotačnú energiu molekúl analytu, a tým znižujú stupeň fragmentácie spôsobenej elektrónmi počas ionizačného procesu. Hmotnostné spektrá studenej EI sa vyznačujú bohatým molekulárnym iónom, zatiaľ čo sa zachováva obvyklý fragmentačný obrazec, čo umožňuje, aby hmotnostné spektrá studenej EI boli kompatibilné s technikami identifikácie hľadania v knižnici. Vylepšené molekulárne ióny zvyšujú pravdepodobnosť identifikácie známych aj neznámych zlúčenín, zosilňujú hmotnostné spektrálne účinky izomérov a umožňujú použitie analýzy nadbytku izotopov na objasnenie elementárnych vzorcov.

Chemická ionizácia (CI)

Pri chemickej ionizácii sa do hmotnostného spektrometra zavádza plynný reagent, zvyčajne metán alebo amoniak . Patrí medzi tzv. mäkkú ionizačnú techniku, vzhľadom k tomu, že k ionizácii molekúl dochádza prostredníctvom elektrónov s nízkou energiou. Poznáme pozitívnu PCI alebo negatívnu NCI chemickú ionizáciu V závislosti na zvolenej technike, bude tento reagenčný plyn interagovať s elektrónmi a spôsobovať „mäkkú“ ionizáciu sledovanej molekuly. Mäkšia ionizácia fragmentuje molekulu v nižšej miere ako tvrdá ionizácia EI. Jednou z hlavných výhod použitia chemickej ionizácie je, že sa vytvorí hmotnostný fragment, ktorý úzko zodpovedá molekulovej hmotnosti sledovaného analytu. Pri pozitívnej chemickej ionizácii (PCI) reakčný plyn interaguje s cieľovou molekulou, najčastejšie s výmenou protónov. Pri negatívnej chemickej ionizácii (NCI) reakčný plyn znižuje vplyv voľných elektrónov na cieľový analyt. Táto znížená energia zvyčajne ponecháva iba veľké fragmenty. NCI umožňuje vysokoselektívnu detekciu niektorých organických zlúčenín v ultrastopových koncentračných hladinách, až ppt koncentrácie (10 – 12).

Vzhľadom k tomu, že ide o pomerne rozsiahlu problematiku popisovania tejto analytickej metódy, jej ďalšími časťami zaoberajúcimi sa systémom vykonávania analýzy úplným skenovaním alebo selektívnym monitorovaním (SIM), prípravou vzorky obsahujúcej PCB látky na analýzy GCMS a vyhodnocovanie nameraných spektier softvérmi Chemstation prípadne Mass Hunter sa budeme venovať v ďalšom čísle.